流行性感冒（流感）严重威胁人类健康，禽流感亦给社会经济带来不利影响。流感病毒是引发流行性感冒的元凶。目前预防和治疗流感主要依靠疫苗及抗流感药物。由于疫苗研发相对滞后且接种比例不高，以NA抑制剂(NAI)为代表的抗流感药物成为临床上用来抵抗流感的有利武器。人类历史上经历过四次流感大流行，从导致近5000万人死亡的1918年西班牙大流感到最近的2009年甲型H1N1大流感，以及频发的季节性流感，人类依旧没有摆脱流感病毒的威胁。与其他抗微生物药物一样，在临床使用NAI治疗过程中逐渐出现耐药现象。耐药毒株的出现导致对NAI反应降低、排出毒株时间延长，对患者尤其是儿童、老人及免疫缺陷人群的健康具有重大影响，甚至威胁到生命。目前临床上用于治疗流感的NA抑制剂有四种:oseltamivir、zanamivir、laninamivir和peramivir。在N1亚型中H274Y是最常见的达菲(oseltamivir)耐药突变。在N2亚型中119位和222位是发生耐药突变比较常见的位点。尤其是当E119V和I222L同时存在时，对于达菲的耐药程度显著提高。临床上还观察到Q136K对zanamivir耐受的病例。目前对于N1-H274Y的耐药机制已经得到阐明，但是N2亚型的耐药突变的分子机制尤其是双突变的耐药机制仍不清楚。本文研究发现昆虫系统表达的N2亚型野生型与三种突变体NA蛋白(E119V、I222L和E119V/I222L)对于临床上常用NA抑制剂oseltamivir和zanamivir确实耐受。通过解析这四种蛋白及其与抑制剂的复合物结构阐明了耐药的分子机制。在N2亚型野生型蛋白与oseltamivir的复合物结构中，E119的侧链可与oseltamivir第四位的氨基形成氢键互作，当发生E119V突变后，不能形成氢键互作，所以导致耐药。而对于zanamvir而言，其第四位是胍基，比氨基更大，且极性更强，除了与E119有互作外还可与D151，W178和E227形成氢键，因此在发生E119V突变后并不产生耐药。I222位氨基酸与oseltamivir的疏水基团和乙酰基具有疏水相互作用，当发生I222L后，疏水环境发生改变，导致耐药。而对于zanamivir而言，对应位置是羟基基团，可与E276和R224的侧链具有氢键互作，因此I222L突变仍对zanamivir敏感。此外，本文选取只在136位有差异的两株天然毒株的N2亚型NA为研究对象，在蛋白水平证明Q136K确实导致zanamivir耐受，并解析了两种N2与zanamivir的复合物结构，发现虽然Q136K并不是直接与小分子相互作用的位点，但是这个突变导致了微环境的变化，使得zanamivir产生了偏转，并影响了E276的侧链构象，从而导致对zanamivir耐受。　　本文对于两种新型抑制剂对带有耐药突变的NA进行了抑制效果的评估并阐明了作用机制。其中在与加拿大Mario Pinto课题组合作中发现一种新型NA抑制剂(MS-257)将oseltamivir和zanamivir的优点集于一身，通过解析野生型N2及三种突变体（E119V、I222L和E119V/I222L）与MS-257的复合物结构阐明了其作用方式。抑制实验结果显示MS-257对于N2-Q136K、09N1、09N1-H274Y及09N1-I222R/H274Y有很好的抑制效果，具有进一步开发成药物的潜力。　　共价型抑制剂是NA抑制剂的一种新策略，本课题组研发的共价型抑制剂DFSIA可与NA的406位酪氨酸的酚羟基形成稳定的共价键，之前的抑制实验证明该抑制剂对H3N2和09H1N1病毒有抑制活性。本文中证明该抑制剂对于带有R292K的上海N9具有一定的抑制活性，效果好于oseltamivir。对于带有E119V、I222L、E119V/I222L或Q136K耐药突变的N2亚型NA的抑制效果与野生型在同一水平，但是抑制效果没有oseltamivir和zanamivir好。　　综上所述，本文以带有E119V、I222L、E119V/I222L或Q136K耐药突变的N2亚型NA为研究对象，在蛋白水平检测了这几个耐药突变蛋白对抑制剂的耐受程度，并利用结构生物学方法阐明了耐药机制。另外检测了两种新型抑制剂对多种不同亚型带有耐药突变的NA的抑制效果，并解析了这两种抑制剂与E119V/I222L双突变的复合物结构，阐明了其作用模式，为抑制剂改造提供了理论基础。