论文部分内容阅读
谷氨酰胺作为人体内的“条件必需氨基酸”,对机体免疫功能具有重要作用。正常机体所需谷氨酰胺由机体自身供给不需外源补充,但机体遭受应激或创伤时,免疫系统及肝脏、肾脏和肠道等器官对谷氨酰胺需求增加,需要外源补充谷氨酰胺。具有严重代谢应激的机体补充外源谷氨酰胺后,可以缓解体内谷氨酰胺不足的状况,满足免疫系统和胃肠道新陈代谢的需求。L-茶氨酸是茶叶中的特征性氨基酸,分子结构与生理功能与谷氨酰胺都十分相似,具有调节机体营养代谢、提高免疫功能、抗氧化、提高认知能力等多种健康作用。有推测认为L-茶氨酸在机体内通过调节谷氨酰胺代谢作用于免疫功能,但鲜见相关研究报道。本研究采用低(300 mg/kg·d-1)、中(600 mg/kg·d-1)、高(900 mg/kg·d-1)剂量的L-茶氨酸、L-谷氨酰胺及其组合(L-茶氨酸300 mg/kg·d-1+L-谷氨酰胺600 mg/kg·d-1、L-茶氨酸450 mg/kg·d-1+L-谷氨酰胺450 mg/kg·d-1、L-茶氨酸600 mg/kg·d-1+L-谷氨酰胺300 mg/kg·d-1),分别灌喂正常或E44813应激8周龄SD雄性大鼠21 d,在探究L-茶氨酸对正常及E44813应激大鼠谷氨酰胺代谢和免疫功能调节作用的基础上,选取正常组、E44813组以及L-茶氨酸干预正常组、L-茶氨酸干预E44813应激组中效果较好的组,采用代谢组学和蛋白质组学联合分析方法,预测L-茶氨酸调节正常及E44813应激大鼠谷氨酰胺代谢和免疫功能的作用机制,然后采用Western Blot、计算机模拟分子对接、细胞水平的作用靶点等方法对预测机制进行验证,进而探明了L-茶氨酸对SD大鼠谷氨酰胺代谢与免疫功能的调节作用及机制。主要研究结果及结论如下:（1）L-茶氨酸对正常大鼠谷氨酰胺代谢的调节作用。相比于正常组,中剂量的L-茶氨酸能显著提高肠道与血浆中谷氨酰胺含量的比例和肠道绒毛长度及隐窝深度（p＜0.05）;L-茶氨酸各剂量组骨骼肌的谷氨酰胺合成酶活性升高（p＜0.05）,谷氨酰胺合成酶蛋白表达量有降低趋势,肠道中谷氨酰胺酶活性变化不显著,谷氨酰胺酶蛋白表达量降低（p＜0.05）;说明L-茶氨酸具有提高骨骼肌谷氨酰胺合成酶、肠道谷氨酰胺酶单位蛋白的活性的作用,且以中剂量的L-茶氨酸效果较好。（2）L-茶氨酸对E44813应激大鼠谷氨酰胺代谢和免疫功能的调节作用。SD大鼠经7 d一次的E44813应激处理后,肠道炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均显著高于正常组（p＜0.05）,说明E44813肠道应激大鼠模型造模成功。L-茶氨酸干预E44813应激机体后,能够促进肠道绒毛长度及隐窝深度的增长（p＜0.05）,提高血清中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶的活性（p＜0.05）,降低膜脂过氧化产物丙二醛的含量（p＜0.05）,下调肠道中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量（p＜0.05）;与E44813应激机体外源补充L-谷氨酰胺相比,外源补充相同剂量的L-茶氨酸在提高超氧化物歧化酶活性及下调IL-1β的表达量上的效果更好,同时L-茶氨酸的较优剂量为600 mg/kg·d-1,L-谷氨酰胺剂量为900 mg/kg·d-1时才能达到L-茶氨酸同样的效果;与高剂量L-谷氨酰胺单独使用相比,L-茶氨酸与L-谷氨酰胺联用对缓解机体炎症显示出更强的调节作用（p＜0.05）,L-茶氨酸缓解氧化应激机体炎症的效果优于谷氨酰胺,在一定程度上可替代谷氨酰胺发挥作用,说明L-茶氨酸对氧化应激机体免疫功能的作用通路可能不通过谷氨酰胺代谢。基于以上结果,选取正常组、中剂量L-茶氨酸组、E44813应激组和E44813+中剂量L-茶氨酸组进行组学分析。（3）基于代谢组学和蛋白组学分析预测L-茶氨酸调节E44813应激大鼠谷氨酰胺代谢与免疫功能的蛋白通路。与正常组对比,L-茶氨酸干预后的差异代谢物主要富集于蛋白质消化吸收、氨基酸代谢及嘧啶代谢等通路,差异蛋白质主要富集于丙酮酸代谢、糖酵解、氮代谢、碳代谢、氨基酸代谢、嘌呤代谢以及ECM-受体信号通路等途径;与E44813应激组相比,L-茶氨酸干预E44813应激机体的差异代谢物主要富集在类固醇激素生物合成及氨基酸代谢等通路,差异蛋白质主要富集于MAPK信号通路、PI3 K-Akt信号通路、PPAR信号通路、ECM-受体相互作用通路、VEGF信号通路、TNF信号通路、GABA能突触、谷氨酸能突触以及氧化磷酸化作用等途径。在E44813应激组vs.正常组和E44813+L-茶氨酸组vs.E44813应激组两个比较组的蛋白质组学结果中,挑选出表达量变化趋势相反的差异蛋白质共3个:Atp2b4、Pdcd4和Tspan8,且与其相关的差异代谢物为2-AG。结合以上结果与文献,预测L-茶氨酸调节E44813应激机体免疫功能的途径为:L-茶氨酸通过m Glu R3抑制VEGF对VEGFR2的刺激,下调PLC的表达以抑制PI向2-AG转化,阻止CB1受体的信号传导,上调COX-2抑制Pdcd4的表达,最终通过下调TNF-α并上调IL-10的表达量调节机体免疫功能;预测L-茶氨酸调节E44813应激机体谷氨酰胺代谢的途径为:L-茶氨酸通过上述同样途径抑制CB1受体的信号传导,解除了CB1对ERK1/2磷酸化的抑制,最终通过抑制GS蛋白的表达影响谷氨酰胺代谢。（4）L-茶氨酸调节正常和E44813应激大鼠谷氨酰胺代谢和免疫功能的预测机制验证。Western Blot分析表明,正常机体受到E44813应激后,VEGFR2表达量升高（p＜0.05）,COX-2表达量降低（p＜0.05）,Pdcd4表达量升高（p＜0.01）,p-ERK1/2蛋白表达量降低（p＜0.01）;L-茶氨酸干预E44813应激机体后,VEGFR2表达量有降低趋势,但效果不显著,COX-2表达量升高（p＜0.01）,Pdcd4表达量降低（p＜0.05）,p-ERK1/2蛋白表达量升高（p＜0.05）,p-ERK1/2、COX-2和Pdcd4蛋白水平变化趋势均与（3）中预测机制通路一致;L-茶氨酸干预正常机体后,肝脏中CB1及COX-2的蛋白表达量没有显著变化,Pdcd4蛋白表达量降低（p＜0.01）,p-ERK1/2蛋白表达量降低（p＜0.01）,与（3）中预测通路基本相符。计算机模拟分子对接结果显示,L-茶氨酸与m Glu R3、CB1的结合自由能分别为-15.6 kcal/mol、-39.2 kcal/mol,L-茶氨酸与CB1的结合可能性更大。细胞实验结果表明,正常细胞摄入L-茶氨酸或盐酸利莫那班后,COX-2表达量及IL-10水平升高（p＜0.05）,符合L-茶氨酸-CB1-COX2-Pdcd4-NFκB-IL10的正常机体免疫通路;L-茶氨酸或盐酸利莫那班作用于LPS应激细胞后,COX-2表达量与IL-10水平均升高（p＜0.05）,TNF-α水平降低（p＜0.05）,符合预测机制中L-茶氨酸-CB1-COX2-Pdcd4-NFκB-IL10、TNFα的应激机体免疫通路;正常细胞摄入L-茶氨酸或盐酸利莫那班后,ERK1/2表达量基本无变化,p-ERK1/2占总ERK1/2比例下降（p＜0.05）,GS表达量升高（p＜0.05）,符合推测得出的L-茶氨酸-CB1-Gβy-p ERK1/2-GS的正常机体谷氨酰胺代谢通路;L-茶氨酸或盐酸利莫那班作用于LPS应激细胞后,ERK1/2水平基本不变,p ERK1/2占总ERK1/2比例上升（p＜0.05）,GS表达量降低（p＜0.05）,符合预测中L-茶氨酸-CB1-p ERK1/2-GS的应激机体谷氨酰胺代谢通路。综上,在正常机体中L-茶氨酸竞争性结合CB1,抑制了通过Gβy的ERK1/2磷酸化途径,影响了谷氨酰胺代谢关键酶GS的表达,进而调节谷氨酰胺代谢;同时L-茶氨酸拮抗CB1活性后,解除了CB1对COX-2表达的抑制,下调Pdcd4及NFκB的表达,最终通过增强抗炎因子IL-10的表达提高了机体免疫功能。在E44813应激机体中L-茶氨酸通过抑制CB1的活性,促进p ERK1/2的核转移,影响了谷氨酰胺关键酶GS,进而调节谷氨酰胺代谢;同时L-茶氨酸拮抗CB1活性后,通过与正常机体中相同的COX2-Pdcd4-NFκB途径,上调抗炎因子IL-10的表达量,下调促炎因子TNF-α的表达量,最终达到提高机体免疫功能的作用。