研究背景:癫痫(epilepsy)是一种常见的神经系统疾病。全球3000多万人患有癫痫,每年新增150万,我国有800万左右患者,其中25%-40%为难治性癫痫(Refractory epilepsy,RE)。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是最常见的难治性癫痫类型,主要特点是逐渐进展的自发性癫痫反复发作(spontaneous recurrent epileptic seizure,SRS)和海马硬化(Hippocampal sclerosis,HS)。HS 主要病理改变为海马CA1及CA3区锥体细胞层和齿状回区神经元的损伤及星形胶质细胞的大量增生。海马损伤既是癫痫发作的结果又是颞叶癫痫形成的原因,急性期的神经元损伤逐渐发展为慢性期以SRS为特征的慢性颞叶癫痫,进而表现为学习及认知功能障碍。氯化锂-匹罗卡品(Pilocarpine,Pilo)癫痫点燃模型是最为常用和理想的癫痫模型,该模型较好地模拟了人类癫痫的发生、进展及形成的全过程,根据该模型的病理基础,分为SE后0-72 h的急性期、4-7天的延续性毒性阶段、持续14-15天的潜伏期以及持续数周甚至数月的慢性期。其所致海马区神经元损伤与人类颞叶癫痫的病理生理机制类似,是目前研究惊厥持续状态(status epilepticus,SE)和 SRS 最常用的模型之一。关于癫痫的病理生理机制仍不清楚,也极为复杂,目前有多种观点,主要包括以下几个方面:神经元电位异常、离子通道异常、中枢神经系统的神经递质失衡、免疫功能异常、细胞凋亡、基因异常等,其中中枢神经系统兴奋性及抑制性神经递质平衡紊乱是导致癫痫发生的经典机制。在正常的生理状态下,谷氨酸(L-glutamicacid,Glu)与 Y-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)存在一个代谢循环的回路,维持着神经元兴奋与抑制的平衡。而一旦这种平衡失调,Glu与GABA不再保持平衡的稳态,便会引起神经元异常放电,导致神经微环路出现紊乱,过剩的Glu神经递质的释放在癫痫的发生、发展过程中起着关键性作用,其介导的神经细胞损伤与癫痫密切相关。Glu受体分为离子型和代谢型两大类。离子型Glu受体(ionotropic glutamate receptor,iGluR)是非特异性阳离子通道,包括N-甲基-D门冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid,NMDA)、α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionicacid,AMPA)和海人酸(kainicacid,KA)受体。AMPA 受体是除NMDA受体外的另一类重要的兴奋性氨基酸特异性受体,它主要介导快速的兴奋性递质传递,广泛分布于中枢神经系统,他的过度激活可以提高神经元兴奋性,在癫痫的发病中起着重要作用。在一系列动物模型和人类癫痫中,AMPA受体拮抗剂已显示有抗癫痫作用,但AMPA受体除参与中枢神经系统的快速兴奋性突触传递外,对突触的传递效率、神经元的整合功能以及突触的可塑性均有影响,因此应用AMPA受体拮抗剂治疗癫痫的同时,影响了 AMPA受体的正常功能,其临床应用受限。AMPA受体所介导的神经毒性作用的主要病理机制为受体激活后大量Ca2+内流所导致的细胞内钙超载。AMPA受体由GluR1-GluR4四个亚单位组成,由GluR1/3/4亚基构成的同聚体或异聚体Ca2+通透性高,而含GluR2亚基的AMPA受体异聚体呈现低Ca2+通透性。四个亚单位在大脑的表达有区域差异,GluR1-GluR3主要在前脑表达,而海马、齿状回颗粒细胞表现出GluR2亚基的高表达,80%海马CA1区椎体神经元的AMPA受体是GluR1/GluR2异聚体形成。关于激活含有低Ca2+通透性的GluR2亚基的AMPA受体是怎样介导海马神经元损伤的机制仍不明确。同样,关于癫痫发作后GluR2亚基的表达及结构、功能的改变存在很多具有争议性的研究与结论。在寻找AMPA受体介导的神经毒性的特定通路中,研究发现了一种由AMPA受体的GluR2亚基和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)组成的蛋白复合物,该复合物在细胞凋亡中可能起着重要作用。不同于其他作用于GluR2亚基位于细胞内的羧基端的绑定蛋白,GAPDH可特异性地绑定于GluR2亚基位于胞外的NT端的Y142-K172区,同时在细胞实验中发现AMPA受体的激活可增强GluR2/GAPDH复合物的耦合作用。这一现象表明GluR2/GAPDH的结合可能参与了 AMPA受体介导的细胞毒性作用。为了研究GluR2/GAPDH复合物的功能作用,我们课题组开发了一种蛋白干扰肽(Competitiveprotein peptid,G-Gpep),它能够专门打断 GluR2/GAPDH 的相互作用,前期研究发现经G-Gpep预处理的原代培养海马神经元能显著减弱AMPA受体介导的细胞死亡,而且脑室内定位注射G-Gpep可挽救缺血性中风动物模型中缺血诱导的CA1区神经元的死亡。基于上述研究基础,我们提出一种以AMPA受体为靶点的新的抗癫痫治疗方法。本研究通过建立氯化锂一 Pilo致痫模型,探讨GluR2/GAPDH耦合现象是否存在于癫痫持续状态的病理过程中,对急性期海马神经元损伤、潜伏期海马神经元存活及慢性期星型胶质细胞增生进行检测,观察致痫大鼠的行为学和空间学习能力改变,评价G-Gpep预处理对海马神经元的保护作用并进一步探讨其可能的作用机制,为癫痫治疗提供新的靶点或方向。本研究分为三个部分:第一部分:G-Gpep预处理对匹鲁卡品致痫大鼠急性期海马神经元损伤的作用目的:本研究通过建立Pilo-癫痫持续状态模型,研究G-Gpep预处理对Pilo致痫大鼠急性期脑损伤是否具有保护作用,分别从大鼠行为学、海马神经元免疫组化等方面进行评价。方法:1、G-Gpep 合成:治疗用 G-Gpep 由 Biomatik 公司(Cambridge,USA)合成。为了协助干扰肽向细胞内转运,G-Gpep被融合入细胞膜转导蛋白HIV-1 TAT结构区[YGRKKRRQRRR],从而形成TAT-GluR2NTT1-3-2肽,蛋白序列为:YGRKKRRQRRR-YYQWDKFAYLYDSDRG-LSTLQAVLDSAAEK,该干扰肽由高效液相色谱法提纯,纯度至少达90%。提纯后干扰肽分装并溶解于生理盐水中,储存于-80℃冰箱备用。2、健康成年雄性Wistar大鼠,随机分为对照组(Control组)、实验组(Pilo组)、G-Gpep预处理组(TAT 5 nmol组,TAT 10 nmol组),G-Gpep预处理组于匹罗卡品注射前60min应用脑立体定位仪分别于侧脑室内注射干扰肽5 nmol及10nmol。3、建模方法:Pilo组先用氯化锂(3mmol/kg)腹腔注射,18-24h后腹腔注射盐酸匹罗卡品(30mg/kg,Sigma公司)诱发癫痫发作。G-Gpep预处理组于匹罗卡品注射前60 min应用脑立体定位仪分别于侧脑室内注射干扰肽5 nmol及10 nmol。对照组用氯化锂腹腔注射后,用等量的生理盐水代替匹罗卡品腹腔注射。匹罗卡品注射后严密观察并记录各组大鼠行为学改变,并以Racine评分标准为依据来判定癫痫发作级别。大鼠出现惊厥持续状态(Statusepilepticus,SE)60-90min以后,再给以10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔内注射解除抽搐发作,SE后72h为实验终点,凡SE持续时间未达到预定标准或中途死亡者均从本实验中排除。4、根据Rcine分级,分别记录各组大鼠癫痫发作的程度分级,发作潜伏期及发作起止时间。5、各组存活大鼠随机选择5-6只,应用Fluoro-Jade B染色法及TUNEL法检测SE后6h、24h、72h海马区神经元退化变性及凋亡情况,同时观察G-Gpep的作用。结果:1、Pilo组大鼠,在被注射Pilo后5分钟至数十分钟开始出现痫样发作,Ⅳ级以上发作的成功率为62.5%。Pilo组大鼠SE诱发成功后至SE后72h期间死亡率为41.2%,TAT 5 nmol 组为:27.3%,TAT 10 nmol组为:16.7%。G-Gpep 预处理组大鼠达到Ⅳ级以上发作的潜伏期(62.62±6.64 min)比Pilo组(18.43±8.86 min)延长(P<0.01),且到达Ⅴ级发作的百分比减低(36.4%)。另外,10 nmol预处理组(70.90±8.12 min)与5 nmol预处理组相比,大鼠达到Ⅳ级以上发作的潜伏期延长(P<0.05),且达到Ⅴ级发作的百分比进一步减低(19%),Control组动物未表现出任何行为学上的癫痫发作。2、Fluoro-Jade B染色结果:FJB阳性变性神经元呈亮黄绿色,每组内每张切片随机挑选3个5×40倍(目镜×物镜)视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件将荧光照片转换为黑白图片然后选取相同的黑色作为判断所有照片阳性的统一标准,对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)。Pilo组及G-Gpep预处理组大鼠SE后6h,CA1区及CA3区即可见少量FJB阳性细胞,但组间差异无统计学意义;SE后24h,Pilo组大鼠CA1区及CA3区FJB阳性变性神经元明显增多(4827.52±105.87,4633.26±45.39),SE 后 72hPilo 组大鼠CA1区及CA3区FJB阳性变性神经元进一步增加(6238.73± 159.89,6065.46±91.23);SE后72h:G-Gpep预处理组大鼠海马CA1区及CA3区FJB阳性变性神经元均较 Pilo 组减少(4935.84 ±51.14,4403.26±89.27)(P<0.05),同时10 nmol预处理组CA1区及CA3区FJB阳性变性神经元计数SE后72 h 均比5 nmol 预处理组更低(2834.53±35.10,2608.17±76.28)(P<0.05)。3、Tunel法检测细胞凋亡,凋亡细胞核固缩呈棕褐色,为圆形,新月形或不规则形。每组内每张切片随机挑选3个5×40倍(目镜×物镜)视野进行拍照,应用Image-Pro Plus6.0软件对照片进行分析得出阳性细胞的比率(阳性细胞数/总细胞数)即为凋亡率。Pilo组及G-Gpep预处理组大鼠SE后6 h,海马CA1和CA3区未见凋亡细胞形态变化,SE后24 h,Pilo组凋亡率明显增加,并于72 h达高峰(34.97±2.26%,39..36±2.15%);SE 后 72h,G-Gpep 预处理组大鼠海马 CA1和 CA3 区凋亡率均较 Pilo 组显著减少(17.81±1.09%,8.53±0.78%)(P<0.05);同时10 nmol预处理组凋亡率比5 nmol预处理组低(8.91 ±0.39%,6.41±0.43%)(P<0.05)。Pilo组和G-Gpep预处理组大鼠海马神经元凋亡率与Control组比较均有显著性差异。结论:1、G-Gpep预处理对Pilo致痫大鼠海马急性期神经元损伤具有保护作用;2、G-Gpep预处理具有抗癫痫作用,大鼠癫痫发作潜伏期延长,发作级别减低;3、G-Gpep的神经元保护作用一定剂量范围内呈现剂量依赖性,10 nmol的作用强于5 nmol。第二部分:G-Gpep预处理对匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元保护机制探讨目的:本研究通过建立Pilo-癫痫持续状态模型,研究SE后24 h大鼠海马组织GluR2的表达情况,GluR2/GAPDH复合物的耦合状态以及GAPDH的核转位情况,并探讨G-Gpep神经元保护作用的可能机制。方法:1、健康成年雄性Wistar大鼠,随机分为对照组(Control组)、实验组(Pilo组)、G-Gpep预处理组(TAT 5 nmol组,TAT 10 nmol组)。干扰肽的合成同第一部分。G-Gpep预处理组于Pilo注射前60 min,应用脑立体定位仪,分别于侧脑室内注射 G-Gpep 5 nmol 或 10 nmol。2、各组存活大鼠随机选择5-6只,于SE后24 h,提取大鼠海马组织总蛋白,并应用免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation,Co-IP),以GluR2作为免疫沉淀蛋白(IP),以GAPDH为免疫印记蛋白(IB)检测大鼠海马组织GluR2/GAPDH复合物形成改变。3、各组存活大鼠随机选择5-6只,于SE后24 h,提取大鼠海马组织总蛋白并应用western blot法,分别检测海马组织总蛋白GluR2及GAPDH的表达情况。4、各组存活大鼠随机选择5-6只,于SE后24 h,应用核蛋白提取试剂盒提取海马组织细胞的核蛋白及胞浆蛋白,并应用western blot法,检测GAPDH核转位情况。结果:1、Co-IP实验结果:将各组胶片进行扫描存档,PhotoShop整理去色,AlphaEase FC软件处理系统分析IB(GAPDH)条带的光密度值。与对照组(53655±2039.02)相比,SE后24 h,Pilo组大鼠与GluR2结合的GAPDH是明显增多的(170800±7984.97)(P<0.05),G1uR2/GAPDH的耦合作用增强,而海马组织蛋白GAPDH的总表达量各组之间差异无统计学意义,GluR2/GAPDH的耦合作用可以被G-Gpep所阻断(143500±7546.57)(P<0.05),同时我们发现10 nmol预处理组(135415±8782.85)的阻断作用要高于5nmol预处理组(P<0.05)。2、海马组织GluR2表达情况:以α-tubulin为内参,结果以目的条带灰度值和内参条带灰度值比值表示。对照组大鼠海马组织GluR2表达值为:0.59±0.03,Pilo 组为:0.86±0.02,TAT5nmol 组为:0.88±0.03,TAT10nmol 组为:0.88±0.06。与对照组相比,SE后24 h,Pilo组、TAT 5 nmol组及TAT 10 nmol组大鼠的GluR2的表达增高(P<0.05);而Pilo组、TAT5 5nmol组、TAT 10 nmol组三组之间比较,GluR2的表达差异无统计学意义(P>0.05)3、GAPDH核转位实验结果:以Histone2B作为核蛋白内参,以α-tubulin为胞浆蛋白内参,结果以目的条带灰度值和内参条带灰度值比值表示。与对照组(0.13±0.02)相比,Pilo组大鼠海马组织核蛋白的GAPDH表达是增加的(0.74±0.07)(P<0.05),而胞浆内GAPDH减少。这提示SE大鼠的GAPDH核转位是增加的,而进一步的实验结果表明,GAPDH的核转位可以被G-Gpep所阻断(0.6± 0.05),10 nmol预处理组的阻断作用要高于5 nmol预处理组(0.48±0.06)(P<0.05)。结论:1、Pilo诱导的SE大鼠海马组织GluR2/GAPDH的耦合作用增强,此耦合作用可以被G-Gpep阻断。2、Pilo诱发的大鼠SE后24h,GluR2的蛋白表达水平是升高的,与Pilo组比较,G-Gpep及不同剂量的G-Gpep预处理对SE大鼠的GluR2表达并无影响。3、Pilo诱导的SE大鼠海马组织GAPDH核转位增加,而G-Gpep可降低GAPDH的核转位,进而阻断GAPDH核转位所导致的细胞毒性作用。4、G-Gpep的阻断作用一定剂量范围内呈现剂量依赖性,10 nmol的作用强于5 nmol。第三部分:G-Gpep预处理对匹鲁卡品致痫大鼠慢性期癫痫发作、认知功能及海马胶质细胞增生的影响目的:本研究通过建立Pilo-癫痫持续状态模型,研究G-Gpep预处理对Pilo致痫大鼠潜伏期海马神经元存活,慢性期癫痫发作、认知功能及海马星形胶质细胞增生的影响,并初步探讨其作用机制。方法:1、健康成年雄性Wistar大鼠,随机分为对照组(Control)、癫痫组(epilepsy-model,EM)、干扰肽预处理组(TAT-GluR2NTl-3-2-pretreatedepilepsy-model,TPEM),及对照肽预处理组(TAT-GluR2NT-scram-pretreated epilepsy-model group,FEM)。G-Gpep及对照肽的合成方法同第一部分。TAT-GluR2NT-scram(对照肽)的蛋白序列为:YGRKKRRQRRR-AFDLSQYDLKWQVDYLKYDYGTASELRASA。干扰肽预处理组及对照肽预处理组,于匹罗卡品注射前60min应用脑立体定位仪,于侧脑室内分别注射 GluR2 NT1-3-2 及 GluR2NT-scram各 10nmol。2、EM组、TPEM组及FEM组成功诱发SRS的存活大鼠随机选择5-6只,于SE后15 d-30d,动态视频监测癫痫发作情况:记录癫痫发作的次数、发作起止时间,并根据Rcine分级法,记录各组大鼠癫痫发作的程度分级。3、SE后30 d各组存活大鼠进行Morris水迷宫检测以评估大鼠的空间学习能力。4、Nissl染色:各组存活大鼠随机选取5-6只,于SE后7 d应用Nissl染色计数海马CA1及CA3区存活的神经元。5、星形胶质细胞(Astrocytes,AST)胞体的GFAP是一种细胞骨架蛋白,可反映星形胶质细胞活化的状态,是其特征性的蛋白标志,同时可特异性地对星形胶质细胞进行标记。各组存活大鼠随机选取5-6只,于SE后3 d、7 d、15 d、30 d用星形胶质细胞特异性标记蛋白GFAP行免疫组化染色,以检测海马星形胶质细胞活化及增生情况。结果:1、各组大鼠每日癫痫发作结果:Control组大鼠未见癫痫发作;EM组大鼠平均每日癫痫发作次数为:8.53±0.45,发作等级为:3.48±0.16,发作持续时间为:62.21±7.49s;与EM组比较,TPEM组大鼠平均每日癫痫发作次数(2.45±0.77)减少(P<0.05)、发作等级分数降低(1.82±0.18)(P<0.05)及发作持续时间(36.47±7.22 s)减低(P<0.05);FEM组癫痫发作次数(8.13±0.46)、发作等级(3.85±0.22)及发作持续时间(61.44±7.28 s)与EM组比较无统计学意义(P>0.05)。2、Morris水迷宫实验结果:定位航行实验,连续测试5 d,第1d和第2d时,各组间无明显的统计学差异(P>0.05)。第3d,第4d和第5d,各组间有明显的统计学差异(P<0.05)。结果表明,随着训练时间的延长,从第3d开始,各组大鼠寻找平台的潜伏期均逐渐缩短(P<0.05),表明各组大鼠对隐藏平台形成了一定的记忆。同时,每个时间点各组大鼠的组间逃避潜伏期也具有统计学差异。与Control组相比,EM组及FEM组大鼠的逃避潜伏期均明显延长(P<0.05),而TPEM组较EM组的潜伏期明显缩短(P<0.05)。在定位航行实验结束后次日,利用空间探索实验对各组大鼠的空间记忆能力进行评估,记录其在120 s内穿越的平台次数及在平台象限的游泳时间。结果显示:与Control组比较,EM组平台象限的游泳时间明显缩短(P<0.05),而与EM组比较,TPEM组平台象限的游泳时间延长(P<0.05);FEM组与EM组两者之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Control组、EM组、TPEM组合FEM组穿越平台的次数分别为:11.2±1.48次,4.2±1.3次,7.4±1.14次,3.8±0.84次。其中TPEM组横跨平台的次数多于EM组(P<0.05)。3、Nissl染色结果:光学显微镜下计数海马CA1和CA3区每1mm区段内细胞膜完整、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计3个区段,并取平均数。结果显示:Control组大鼠海马CA1和CA3区神经元结构完整,无神经元丢失;SE后7 d,EM组及FEM组可见海马CA1区及CA3区神经元丢失明显,表现为细胞形态不完整、排列紊乱,核固缩深染,尼氏小体数量减少或缺失;TPEM组CA1区及CA3区海马神经元细胞结构部分完整,仅少量染色质凝集、尼氏小体数量较EM组明显增加。各组神经元存活数:CA1区:Control组:123.8±5.36;EM 组:45.8±3.11;TPEM 组:77±5.71;FEM 组:46±2.73;CA3 区:Control组:128.4±5.85;EM 组:48.6±2.41;TPEM 组:81.8±2.77;FEM 组:50.4±2.88。与Control组相比,EM组大鼠海马CA1区和CA3区神经元数量均明显减少(P<0.05);而经G-Gpep预处理后,TPEM组的海马存活神经元数量明显增加(P<0.05)。EM组及FEM组两者之间无明显的统计学差异(P>0.05)。4、GFAP染色结果:每组内每张切片随机挑选3个5X40倍(目镜X物镜)视野进行拍照,应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(IOD)。Control组CA1区的星形胶质细胞有基础表达,密度值为(212.20±0.78),形态学表现为胞体较薄,周围突起较少,着色浅淡,EM组星形胶质细胞数量增多且呈现染色深、胞体增大、分支增多的表现,SE后72 h密度值为:2618.09±4.88,7 d:6014.92±4.39:15 d:3213.91 ±2.69,30 d:1251.00±2.36。其中7 d时表达最高;TPEM组GFAP阳性细胞密度值15 d时达到最高(675.15±2.77),30d时显著降低(453.41±2.58),各个时间点均较Pilo组减低(P<0.05),TPEM组的星形胶质细胞较EM组数量减少、胞体减小,染色变浅,细胞密度值明显少于EM组(P<0.01)。FEM组与EM组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠CA3区星形胶质细胞表达情况同CA1区,这提示G-Gpep预处理可抑制匹鲁卡品致痫大鼠海马星形胶质细胞的增殖。结论:1、G-Gpep预处理可减少Pilo致痫大鼠慢性期SRS发作的频率、级别及持续时间。2、Pilo诱导的SE大鼠长期反复痫样发作可出现明显的空间认知功能障碍,而G-Gpep预处理可有效改善大鼠空间学习及记忆能力。3、G-Gpep预处理提高潜伏期海马神经元的存活率,并可有效抑制潜伏期及慢性期海马星型胶质细胞的增生。课题创新性与意义1、本研究通过建立氯化锂-Pilo致痫大鼠模型初步探讨了 SE大鼠海马组织GluR2/GAPDH的耦合作用及GAPDH核转位情况,为癫痫发病机制的研究提供了重要理论依据。2、本研究应用选择性作用于GluR2/GAPDH之间的干扰肽,减少了对AMPA受体正常功能的影响,并在致痫模型中验证了其神经元保护作用,为癫痫的治疗提供新的思路。3、本研究通过多种实验方法检测验证了 G-Gpep对Pilo致痫大鼠海马神经元保护作用以及对慢性期海马胶质细胞增生、癫痫发作以及认知功能的影响,为抗癫痫药物的开发提供了充足实验依据。