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目的 利用全身辐照法构建稳定的小鼠异基因造血细胞移植（allo-HSCT）急性移植物抗宿主病（aGVHD）模型,研究CHI3L1在小鼠aGVHD中的作用机制,探讨CHI3L1对Treg细胞分化及功能的影响。方法（1）C57BL/6（H-2b,♂）小鼠为供鼠,BALB/C（H-2d,早）小鼠为受鼠。30 只 SPF 级 BALB/C 小鼠分为 6 组,分别接受 6.5Gy、7.0Gy、7.5Gy、8.0Gy、8.5Gy及9.0Gy的X射线全身照射。20只BALB/C小鼠经过全身照射预处理后随机分为4组,分别尾静脉注射1 X106,3 ×106,5X 106,,10×106个骨髓细胞重建造血。在重建造血的基础上建立小鼠aGVHD模型,输入10×106个骨髓细胞的基础上再尾静脉输入1X106,3×106,5X106,10X106个脾脏细胞。观察小鼠的生存状态及生存率。HE染色观察靶器官组织病理切片,流式细胞仪检测小鼠嵌合率。（2）建立C57BL/6→BALB/C小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型。30只BALB/C小鼠经过预处理后随机分为三组:单纯骨髓移植组（BM组）为单纯尾静脉注射5X 106个骨髓细胞;野生型aGVHD组（WT组）为尾静脉注射5× 106个骨髓细胞+3×106个WT脾脏细胞;CHI3L1基因敲除aGVHD组（CHI3L1-KO组）为尾静脉注射5×106个骨髓细胞+3×106个CHI3L1-KO脾脏细胞。移植后观察各组临床表现;Log-rank检验各组生存率;移植后20d天各组体重变化;移植后20d天检验各组嵌合率;移植后20天应用组织病理学技术检测各组靶器官肺脏、肝脏、小肠及皮肤的损伤程度。（3）应用流式微珠阵列（CBA）法于移植后20d对各组受鼠血清中多种细胞因子水平进行检测;应用ELISA法对各组受鼠血清中IL-21水平进行检测,应用趋化因子芯片对各组受鼠血清中趋化因子进行检测;应用流式细胞仪于移植后20d对各组脾脏细胞绝对数进行计数;应用流式细胞仪于移植后20d对各组脾脏细胞中CD3、CD4、CD8阳性细胞比例进行检测;应用流式细胞仪于移植后20d对各组脾脏细胞进行胞内染色;检测分泌IFN-γ、TNF-α、IL-6及IL-10的T细胞比例;应用流式细胞仪于移植后20d对各组脾脏细胞中Tfh细胞比例进行检测。（4）建立同种异基因混合淋巴细胞培养（MLR）体系,以BALB/C小鼠来源的非CD3+T细胞作为刺激细胞,以WT供鼠和CHI3L1-KO供鼠CD3+T细胞作为反应细胞并进行羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记,共同培养5d,检测WT供鼠和CHI3L1-KO供鼠CD3+T细胞的增殖能力。（5）应用Real-time PCR技术对各组肺脏、肝脏、小肠及皮肤中IFN-y、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-21、CXCL9、CXCL11 及 CXCL13 mRNA 表达水平进行检测。（6）应用 Western blot技术对各组靶器官如肺脏、肝脏、小肠及皮肤ICOS、AKT/P-AKT、ERK/P-ERK蛋白表达水平进行检测。（7）从WT和CHI3L1-KO C57BL/6小鼠脾脏中分别分离CD4+T细胞,2ug/ml抗CD3单克隆抗体包被,在含有1ug/ml抗CD28单克隆抗体和IL-2 100U/ml的RPMI-1640完全培养基中培养3周,流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+T 淋巴细胞的比例。（8）从 WT 和 CHI3L1-KO C57BL/6 小鼠脾脏中分别分离CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞,随后从WT组分离出CD4+CD25-T细胞并应用CFSE标记,共培养三天后应用流式细胞仪检测CD4+CD25-T细胞增殖情况。（9）再次建立C57BL/6→BALB/C小鼠清髓性异基因骨髓移植aGVHD模型。30只BALB/C小鼠经过预处理后随机分为三组:单纯骨髓移植组（BM组）为单纯尾静脉注射5 ×1 06个骨髓细胞;野生型aGVHD组（WT组）为尾静脉注射5×106个骨髓细胞+3×106个WT脾脏细胞;CHI3L1基因敲除aGVHD组（CHI3L1-KO组）为尾静脉注射5×106个骨髓细胞+3×106个CHI3L1-KO脾脏细胞。模型建造成功20d后对各组受鼠脾脏细胞中CD3+CD4+CD25+Foxp3+ Treg 比例进行检测。（10）应用 Real-time PCR 技术对各组受鼠脾脏、肺脏、肝脏、小肠及皮肤中Sirt-1 mRNA表达水平进行检测。结果（1）接受X射线全身照射的小鼠中,照射剂量6.5Gy的小鼠全部存活,照射剂量7.0Gy的小鼠中位生存期为32天,40天65%死亡。照射剂量7.5Gy的小鼠中位生存期为25天,40天85%死亡。照射剂量为8.0Gy的小鼠中位生存期为18天,40天100%死亡。照射剂量为8.5Gy的小鼠中位生存期为10天,40天100%死亡。照射剂量为9.0Gy的小鼠中位生存期为5天,40天100%死亡。采用Log-rank检验分析生存时间,χ 2=67.4,P<0.0001。尾静脉输入5× 106个骨髓细胞可成功重建造血,100天的生存率达到100%。并且,单纯输入骨髓细胞不会诱导小鼠aGVHD的发生。1× 106个脾脏细胞输入尾静脉诱导的小鼠aGVHD程度较轻,30%出现aGVHD相关性死亡。3×106个脾脏细胞输入尾静脉诱导的小鼠aGVHD程度中等,中位生存期为38.5天,100%出现aGVHD相关性死亡。5×106个脾脏细胞输入尾静脉诱导的小鼠aGVHD程度属于重度,100%出现aGVHD相关性死亡。10 × 106个脾脏细胞输入尾静脉诱导的小鼠aGVHD程度属于极重度,100%出现aGVHD相关性死亡。其中,3×106个脾脏细胞输入尾静脉诱导的小鼠靶器官（肺、肝、小肠、皮肤）出现典型的aGVHD病理表现,14天后为完全供体嵌合状态。（2）于WT组相比,CHI3L1-KO组诱导出的aGVHD临床表现更加严重,CHI3L1-KO组出现更加严重的肺脏、肝脏、小肠及皮肤的病理改变。两实验组受鼠生存率以及体重变化具有明显统计学差异（P<0.0001）。两实验组受鼠嵌合率均达到完全嵌合程度。（3）CHI3L1-KO组小鼠外周血细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6及IL-21水平升高,外周血IL-10水平降低,与WT组相比差异具有统计学意义（P<0.0001）;、CHI3L1-KO组小鼠外周血趋化因子CXCL9、CXCL10及CXCL13 水平升高,与WT组相比差异具有统计学意义（P<0.0001）;CHI3L1-KO组小鼠脾脏细胞绝对数明显减少,与WT组相比差异具有统计学意义（P<0.0001）;CHI3L1-KO组小鼠脾脏细胞中CD3、CD4及CD8 阳性细胞比例明显增加,与WT组相比差异具有统计学意义（P<0.0001）;CHI3L1-KO组小鼠脾脏细胞胞内染色中CD3+CD4+IFN-γ+ T细胞、CD3+CD4+TNF-α+T细胞、CD3+CD4+IL-6+T细胞、CD3+CD8+IFN-γ+T细胞、CD3+CD8+TNF-α+T细胞及 CD3+CD8+IL-6+T细胞比例明显增加,CD3+CD4+IL10+T细胞和CD3+CD8+IL-10+T细胞比例明显降低,与WT组相比差异具有统计学意义（P<0.0001）;CHI3L1-KO组小鼠脾脏细胞中Tfh细胞比例明显增加,与WT组相比差异具有统计学意义（P<0.0001）。（4）在MLR实验中,与CFSE标记的WT供鼠CD3+T细胞相比,CFSE标记的CHI3L1-KO供鼠CD3+T细胞增殖能力明显增强,差距具有统计学意义（P<0.0001）。（5）与WT组相比,CHI3L1-KO组肺脏、肝脏、小肠及皮肤中 IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-21、CXCL9、CXCL10 及 CXCL13 mRNA表达水平明显增高,而肺脏、肝脏、小肠及皮肤中IL-10水平明显降低,差距具有统计学意义。（6）与WT组相比,CHI3L1-KO组肺脏、肝脏、小肠及皮肤中ICOS、P-AKT、P-ERK蛋白表达水平明显增强。（7）与WT型小鼠CD4+T细胞相比,CH13L1-KO小鼠CD4+T细胞分化为CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的能力明显减弱,差距具有统计学意义（P<0.0001）。（8）、与WT型小鼠CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞相比,CHI3L1-KO 小鼠 CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞抑制CD4+CD25-T细胞增殖能力减弱,但差距无统计学意义。（9）、与WT组相比,CHI3L1-KO组受鼠脾脏细胞中CD3+CD4+CD25+Foxp3+Treg比例明显减少,差距具有统计学意义（P<0.0001）。（10）、与WT组相比,CHI3L1-KO组受鼠脾脏、肺脏、肝脏、小肠及皮肤中Sirt-1mRNA表达水平明显增高,差距具有统计学意义（P<0.0001）。结论 8.0GyX射线全身照射剂量对于BALB/C小鼠为清髓照射剂量,预处理后尾静脉输入5× 106个骨髓细胞可成功重建造血。尾静脉输入3×106个脾脏细胞即可诱导典型的小鼠aGVHD。供鼠脾脏细胞CHI3L1缺失可明显加重aGVHD,并对脾脏中Treg细胞的分化产生抑制作用。