研究背景葡萄糖摄取是机体内新陈代谢中极其重要的一个生物进程且调控着人类机体内的多个信号通路及蛋白表达,葡萄糖摄取障碍会导致胰岛素抵抗以及其他代谢的异常,进而诱发糖尿病以及癌症等威胁人类健康的各种疾病。棕榈酸(PA)做为饱和脂肪酸的一种已经被证明了可以诱导肝细胞形成葡萄糖摄取障碍,建立胰岛素抵抗模型。微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)是一类非编码的小分子单链RNA,通过与其目标m RNA分子的3’端(3’UTR)互补匹配导致该m RNA分子的翻译受到抑制,而后在分子水平上调控各种信号通路。有大量研究结果显示mi RNAs可以调控葡萄糖动态平衡。mi R-195也已经被证明,可以调控多种信号通路及蛋白的表达且与糖尿病的发生及发展有着密切关联,但其对葡萄糖摄取进程的影响及具体分子机制尚不明确。研究目的1.明确mi R-195在棕榈酸诱导的肝细胞L02葡萄糖摄取障碍中是否表达异常;2.验证mi R-195是否调控肝细胞L02的葡萄糖摄取障碍进程;3.mi R-195靶基因的筛选及验证;4.探究mi R-195在肝细胞L02葡萄糖摄取障碍中的具体机制。第一部分PA处理肝细胞L02后micro RNA-195表达变化情况以不同浓度棕榈酸PA(0.6 mmol/L,1 mmol/L)分别诱导肝细胞L02 8h,于倒置显微镜下观察处理后的肝细胞L02的形态,然后运用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测各个组中肝细胞L02的葡萄糖摄取能力,RT-PCR技术检测mi R-195的表达变化情况。研究方法1.倒置显微镜下观察棕榈酸处理肝细胞L02后的形态变化;2.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测不同浓度棕榈酸处理肝细胞L02后葡萄糖摄取能力;3.实时定量PCR检测葡萄糖摄取障碍后mi R-195表达变化。实验结果1.显微镜下初步观察到棕榈酸(PA)处理的肝细胞L02的细胞形态明显模糊化,边缘不清晰无明显棱角且呈椭圆状,细胞与细胞间隔松散无清晰界限,细胞核增大;2.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测结果证实(0.6 mmol/L和1 mmol/L)浓度的PA处理肝细胞L02后细胞培养液上清中的葡萄糖浓度比对照组高,说明肝细胞L02在一定浓度棕榈酸的诱导下葡萄糖摄取能力降低,且随着PA浓度的提高,其葡萄糖摄取能力有越来越低的趋势;3.实时定量PCR检测结果显示肝细胞L02葡萄糖摄取障碍后mi R-195表达升高。结论0.6 mmol/L,1 mmol/L的PA诱导肝细胞L02葡萄糖摄取障碍,且肝细胞L02葡萄糖摄取障碍后mi R-195高表达。第二部分micro RNA-195对肝细胞L02葡萄糖摄取的影响葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测高表达及低表达mi R-195后其葡萄糖摄取能力的变化以及棕榈酸处理高表达及低表达mi R-195后的肝细胞L02的葡萄糖摄取能力的变化。Western-blot法验证GLUT1和GLUT4在高表达及低表达mi R-195后的表达变化。研究方法1.激光共聚焦检测肝细胞L02转染mi R-195 mimic以及mi R-195 inhibitor后的荧光强度,计算转染效率;2.实时定量PCR检测肝细胞L02转染mi R-195 mimic以及mi R-195 inhibitor后的mi R-195的表达;3.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测mi R-195高表达及低表达后肝细胞L02葡萄糖摄取能力的变化;葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测棕榈酸处理mi R-195高表达及低表达后的肝细胞L02的葡萄糖摄取能力的变化;4.Western-blot法检测mi R-195高表达或低表达后GLUT1和GLUT4的表达。实验结果1.激光共聚焦检测肝细胞L02转染mi R-195 mimic以及mi R-195 inhibitor后的转染效率达到40%;2.实时定量PCR的结果证实了肝细胞L02转染mi R-195 mimic后mi R-195的表达升高,转染mi R-195 inhibitor后mi R-195的表达降低;3.葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法结果证实了过表达mi R-195后肝细胞L02葡萄糖的摄取能力较Control降低,低表达mi R-195后肝细胞L02葡萄糖摄取能力较Control组有所提高。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法的结果证实了PA诱导与mi R-195高表达同时干预有增强葡萄糖摄取障碍的趋势;4.Western-blot的结果证明了高表达mi R-195下调葡萄糖转运体GLUT1的表达。结论过表达mi R-195后肝细胞L02的葡萄糖摄取能力较对照组降低,而低表达mi R-195后肝细胞L02葡萄糖摄取能力较对照组有所提高;榈酸处理与mi R-195高表达同时作用于肝细胞L02可加强其葡萄糖摄取障碍;过表达mi R-195可下调葡萄糖转运体GLUT1的表达。第三部分micro RNA-195靶基因Sirt-1的预测及验证基于多种数据库分析预测mi R-195的靶基因以及Western-blot法验证其是否为miR-195的靶基因,并探究其靶基因与葡萄糖代谢相关蛋白之间的作用机制。研究方法1.基于多种数据库分析预测mi R-195的靶基因;2.Western-blot检测mi R-195高表达及低表达后候选靶基因Sirt-1的表达变化;3.Western-blot检测Sirt-1表达被干涉后GLUT1和GLUT4的表达变化。实验结果1.多种数据库分析预测mi R-195的靶基因可能性较大的为Sirt-1;2.Western-blot检测mi R-195高表达后Sirt-1表达降低,低表达后Sirt-1表达升高;3.Western-blot检测Sirt-1表达被干涉后GLUT1和GLUT4表达均降低。结论mi R-195的靶基因很有可能是Sirt-1,并且mi R-195通过下调Sirt-1来降低GLUT1和GLUT4的表达,进而来调控肝细胞L02的葡萄糖摄取。