背景与目的遗传性牙酿纤维瘤病(hereditary gingival fibromatosis,HGF),是一种病因不明的口腔罕见良性病变,该病大多存在家族聚集性,故又名家族性牙龈纤维瘤病,主要表现为牙龈的弥漫性、渐进性增生,病变可累及全口的龈缘、龈乳头和附着龈,增生的牙龈可覆盖部分或整个牙冠,多同时伴有乳牙滞留、恒牙迟萌、牙齿错位、错畸形等症状,导致牙列甚至颌面部的形态异常,严重影响患者的咀嚼、美观与发音,易使患者产生自卑感。增生的牙龈色粉红,表面光滑或呈颗粒状、结节状,组织坚韧,点彩明显,不易出血。遗传方式为常染色体显性或隐性遗传,少数病例表现为没有家族史的散发病例,国外发病率为1/175000,无性别差异,外显率具可变性。迄今为止,已经研究定位了多个与HGF相关的位于不同染色体上的基因座,分别为 2p21-p22(GINGF1),5q13-q22(GINGF2),2p22.3-p23.3(GINGF3),11p15(GINGF4),4q12(GINGF5)。但是目前被成功克隆与鉴定的致病基因仅有SOS1和REST,这些研究表明HGF具有高度的遗传异质性。因此,本研究拟通过对该HGF大家系进行家系调查及患者临床特征分析、已报道致病基因的突变检测、全外显子组测序及家系共分离寻找致病基因,为牙龈组织的生理发育提供新线索,为HGF的临床诊治、遗传咨询和预防提供新的理论依据和新的研究靶点。材料与方法第一部分 HGF患者家系调查及临床特征分析本家系共4代48人,经临床检查确诊患者19人。对患者进行详细的全身健康情况及口腔专科检查,并询问患者的既往史及用药史,排除药物和全身系统疾病引起的牙龈增生,明确患者属于不伴有其他综合征的HGF。收集患者行牙龈切除术后去除的牙龈组织进行HE和Massion染色,观察患者的组织学变化,明确病理诊断。第二部分HGF已报道致病基因的突变检测收集HGF大家系成员的外周静脉血,经酚/氯仿法提取基因组DNA,通过NCBI进行特异性引物设计,PCR扩增SOS1、REST因的全部外显子区域,双向直接测序,使用DNAStar-Seqman软件对每一个测序结果进行比对(与UCSC网站查询到的基因外显子序列),查看测序峰图寻找是否存在异常改变。第三部分HGF家系样本全外显子组测序分析提取HGF大家系中Ⅱ-6、Ⅲ-6和Ⅳ-10(Ⅰ-Ⅳ代表家系世代数)的全基因组DNA,检测DNA浓度、纯度和完整性后交由北京诺禾生物有限公司进行高通量外显子组测序,该技术平台采用Aglient SureS elect外显子靶向序列富集系统捕获全外显子序列,然后利用Illumina HiSeq2000对捕获文库进行高通量测序。结果HGF患者临床特征:多数患者嘴唇微突,上下咬合时增生牙龈相互接触,恒牙均完全萌出但因增生牙龈导致排列不齐,牙龈广泛地渐进性增生,全口牙列以后牙区增生明显,牙龈向颊舌侧呈结节状增生,但青少年患者的前牙区增生相对较重,增生牙龈色粉红,表面呈颗粒状或结节状,组织坚韧,点彩明显。HGF患者病理特征:HE染色显示,牙龈的鳞状上皮层异常增生,上皮钉突明显延长并深入固有层;结缔组织中存在大量致密增生的胶原纤维束;成纤维细胞与血管成分较少。Massion染色显示,患者的牙龈结缔组织疏松,充满粗大致密的胶原纤维束,其胶原成分明显富集。致病基因的突变筛查:全血样品经酚/氯仿法提取的模板DNA浓度均大于200ng/μl,A260/A280在1.8～2.0之间,基因组DNA的浓度、纯度均满足后续实验要求。设计SOS1、REST基因全部外显子区域的特异性引物进行突变验证,在已报道的致病位点均未发现突变。此外,全外显子组测序结果也排除了SOS1、REST基因,该结果中筛查出的十多个候选致病基因经家系共分离验证后确认皆为单核甘酸多态性(SNP)位点。结论1.HGF患者根据临床表型及病理改变,明确诊断不难,但是其高度的遗传异质性,极大复杂化了致病机制研究。2.SOS1和REST基因是目前被成功克隆与鉴定的致病基因,但是并不是该家系的“突变热点”。3.该家系的致病基因可能未在已知的基因编码区,而是位于基因的高度重复序列、侧翼序列或内含子内。