霍乱是一种流行性的肠道感染疾病,人体感染后会引起剧烈的水样腹泻、脱水痉挛、甚至死亡等症状,该疾病传播快、病死率高,至今仍是发展中国家人民生命安全的巨大威胁。霍乱弧菌是引起霍乱的病原体,它是一种革兰氏阴性、单鞭毛、具有游动性的弧状细菌,通常生活在江河入海口的淡盐水环境中,通过受污染的水或食物进入宿主体内,在克服了胃酸和宿主的免疫抵御后,可穿过黏液层定殖到小肠上皮细胞表面,之后由腹泻排出体外再次进入到水生环境中。在这个循环过程中,霍乱弧菌会遭遇各种环境压力,包括由活性氧物质造成的氧化压力。霍乱弧菌通常通过调控其体内一系列抗氧化基因表达的抗氧化蛋白来保护自身免遭这些氧化压力造成的损伤。这些蛋白包括过氧化氢酶KatG、过氧化物酶PrxA以及有H202清除活力的DNA结合蛋白Dps等,其中受转录调控因子OxyR正调控的prxA基因对霍乱弧菌抗氧化压力起着重要的作用。为了更好地理解霍乱弧菌如何应对环境中氧化压力,我们通过生物信息学方法定位了霍乱弧菌基因组中编码过氧化物酶AhpC的基因,并在其邻近位置发现了另外一个OxyR同源蛋白,其与霍乱弧菌中原有的OxyR有着49%的序列同源性,且该OxyR同源物中也同样含有两个保守的半胱氨酸残基C206和C215,因此我们将原oxyR基因重新命名为oxyR1,将新发现的oxyR命名为oxyR2。通过冷光报告质粒检测,发现oxyR2正调控ahpC的表达,该表达与环境中是否存在氧化压力无关;而oxyR1不调控ahpC的表达。OxyR1中的第199位的半胱氨酸残基和OxyR2中的第206位的半胱氨酸残基对其各自的调控功能至关重要。将oxyR2和ahpC基因框内敲除后,通过H202处理下生长曲线的测定及杀菌实验的检测,发现oxyR2和ahpC基因的缺失使得霍乱弧菌对H2O2的耐受性增强。为了研究霍乱弧菌在面对氧化压力下基因表达的差异,以及oxyR2和ahpC基因在其抗氧化过程中所起的作用,我们通过RNA sequencing,对霍乱弧菌野生型菌株、ΔoxyR2缺失株、ΔoxyR1缺失株应对H2O2时的转录谱进行了分析,结果显示受oxyR2调节的基因与受oxyR1调节的基因之间有所重叠,如一些ROS抗逆相关基因vc0139(dps)、vc2637(prxA)等,这些受oxyR1正调控的基因同时也受oxyR2的负调控。之后我们通过构建PprxA-luxCDABE报告载体,进一步研究发现OxyR2正调控ahpC的表达并进一步抑制prxA表达,这种抑制作用是通过OxyR1实现的。为了探究oxyR2和ahpC在抗氧化过程中的作用,我们在加有不同浓度H202的AKI培养基中厌氧培养霍乱弧菌野生型菌株、ΔoxyR2缺失株、ΔahpC缺失株,发现在较低浓度的H2O2条件下,ΔoxyR2和ΔahpC都显示出了生长缺陷,说明oxyR2激活的ahpC可能有助于清除对细胞产生损伤时的低浓度的H2O2,并推测当H202浓度超过一定阈值或缺乏oxyR2/ahpC时,会激活oxyR1调节的prxA表达,来清除较高水平的H2O2。为了确认oxyR2和ahpC对霍乱弧菌生理功能的影响,我们分别进行了乳鼠和成年鼠体内竞争性定殖实验以及模拟体外水生环境的人造海水中的存活率检测,结果表明oxyR2和ahpC的缺失并不影响其在乳鼠和成年鼠体内的定殖,但却明显降低其在人造海水环境中的存活率。说明oxyR2激活的ahpC有利于缓解环境中低水平的氧化压力。综上所述,我们的研究结果表明oxyR2和ahpC对霍乱弧菌缓解氧化压力及环境生存起着重要的作用。