目的:人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）,属于逆转录病毒科慢病毒属,是艾滋病即获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）的病原体。由于HIV自身的高突变率、高重组率和较高的复制动力学特点,造成了HIV基因的多样性。目前,HIV分为不同的型、群、亚型和流行重组型,各型病毒具有特定的地区分布和流行特点。欧美等发达国家主要以B亚型毒株流行为主,但全球88%的HIV感染者却来自HIV-1的非B亚型毒株的流行地区。CRF01＿AE毒株是世界上发现最早和影响最广的重组型HIV-1毒株,是我国及东南亚地区的主要流行株,具有传播范围广、流行时间长、控制难度大等特点。艾滋病是威胁人类健康的重大传染性疾病,截至2020年底,全国报告存活HIV感染者已达114万[1],艾滋病流行和防治的形势依然严峻。高效联合抗逆转录病毒治疗（Highly active antiretroviral therapy,HAART）是目前最为有效的治疗艾滋病和控制HIV传播的方法,但随之出现的日益严重的HIV耐药也成为影响治疗效果的主要障碍。为此,WHO于2002年发起在全球范围开展HIV耐药的检测和监测工作。国际上常用的耐药检测方法主要有基因型和表型耐药检测方法,而方便且实用的HIV基因型耐药检测的应用日益广泛。但是,目前针对HIV基因型耐药检测结果的解释规则都是以欧美B亚型毒株的相关数据为基础建立起来的,随着越来越多的非B亚型毒株的感染者正在或即将接受治疗,上述规则是否完全适用于非B亚型毒株值得深入研究。国外的多项研究已经表明在药物的作用压力下非B亚型毒株表现出有别于B亚型毒株的耐药突变特征。如蛋白酶抑制剂-奈非那韦（NFV）对于B亚型毒株经常选择出D30N,而在其他亚型却极少出现这种主要耐药突变[2];C亚型毒株对于核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）的治疗进化出独特的混合胸苷类似物突变路径（K67N/K70R/T215Y）[3]。上述结果都提示,目前采用的基于B亚型毒株的相关数据建立起来的检测方法可能并不完全适用于非B亚型毒株。我国自2003年开始在全国范围开展大规模免费的艾滋病抗逆转录病毒治疗,截至2020年底,累计治疗人数已达97.8万[4]。随着我国艾滋病抗病毒治疗的普及,HIV毒株的耐药以及耐药株的传播也越发严重并且引发关注。同时,我国的医疗资源仍十分有限,对HIV的耐药研究仍处于监测阶段,需要更多针对我国流行毒株特征的耐药基础研究积累。CRF01＿AE毒株作为我国主要流行的HIV-1毒株之一,国内、外仅有一些对当地流行毒株的分子流行病学特征的描述性研究,如泰国、新加坡以及国内的福建、云南、广西等地,少有相关耐药机制的研究报道,亟待加强对我国CRF01＿AE毒株耐药特征的表型耐药基础研究。HIV的pol基因是目前我国应用的抗病毒治疗药物的作用靶位,本研究选取我国CRF01＿AE毒株的未治疗者和治疗失败者的pol基因序列,同美国B亚型毒株序列进行比较分析,获得我国CRF01＿AE毒株的特异性基因自然多态性和耐药特征。通过表型耐药研究分析我国CRF01＿AE毒株特异性的基因特征对于毒株耐药的作用,揭示其是否存在独特的耐药路径或机制,为科学地指导我国的抗病毒治疗提供理论支持。研究方法:1、研究对象本研究入选我国CRF01＿AE和美国B亚型毒株感染者的治疗前、后的pol基因序列进行比较和突变关联分析。根据分析的结果,选择携带有L228R突变的我国CRF01＿AE毒株治疗失败者的耐药株pol序列构建功能性假病毒,进行表型耐药检测分析L228R对CRF01＿AE毒株耐药的作用。2、系统进化分析和基因型耐药检测入选的基因序列经过严格的筛选和质量控制,采用Mega 6.0软件进行序列系统进化分析和亚型确认后,并将序列提交斯坦福大学HIV耐药数据库进行基因型耐药分析,根据回馈的结果确定耐药变异的位置、种类。3、遗传屏障的计算计算毒株发生某耐药突变时核苷酸替换的权重分数,再通过统计方法分析不同亚型毒株发生耐药突变的遗传屏障的差异性。4、基于选择压力原理的生物信息学分析采用Cor Mut软件计算和比较阳性选择突变间的相关性,应用Cytoscape软件绘制相关位点突变的相互作用关系网络图。5、表型耐药检测本研究采用实验室建立的In-house HIV-1重组假病毒表型耐药研究方法检测毒株的药物敏感性,包括病毒核酸提取、毒株pol基因片段扩增和回收、对pol基因的耐药突变回复改造、携带目的基因的嵌合质粒构建、功能性假病毒的获得以及假病毒表型耐药检测和分析等部分。6、统计学处理本研究涉及我国CRF01＿AE毒株和美国B亚型毒株pol基因各位点突变率的比较均采用构建的二项分布模型进行统计分析;采用基于选择压力计算的Cor Mut软件进行突变间作用关系的分析;其他的统计计算均由SPSS 18.0软件和EXCEL软件完成。结果:1、我国CRF01＿AE HIV-1毒株的基因自然多态性研究1.1我国CRF01＿AE毒株pol基因编码氨基酸自然多态性特征采用二项分布模型对入选的1374条我国CRF01＿AE毒株和828条美国B亚型毒株未治疗者的pol基因编码氨基酸的突变频率进行统计分析。我国CRF01＿AE毒株在蛋白酶（以下简称PR）区和逆转录酶（以下简称RT）区分别发现在27个和47个氨基酸位点上存在多态性。其中,14个PR区氨基酸位点和29个RT区氨基酸位点的突变频率显著高于美国B亚型毒株,是我国CRF01＿AE毒株的亚型特异性的氨基酸自然多态性特征。1.2我国CRF01＿AE毒株亚型特异性耐药相关氨基酸多态性特征通过与不同的HIV基因型耐药检测评价系统所列的HIV耐药相关突变位点比较,发现在我国CRF01＿AE毒株的共计43个亚型特异性多态性位点中有PR区的10个多态性位点（包括16、20、35、36、41、69、70、82、89和93位）以及RT区的4个多态性位点（包括69、118、179和238位）属于耐药相关突变位点,是我国CRF01＿AE毒株的亚型特异性耐药相关多态性特征。1.3我国CRF01＿AE毒株的pol基因特征对耐药株进化的遗传屏障存在影响进一步分析我国CRF01＿AE毒株与B亚型毒株在氨基酸密码子特征上的差异对于毒株耐药的影响,我们分别计算了两种亚型毒株进化为主要耐药突变的遗传屏障。经过比较,我国CRF01＿AE毒株在多个位点的主要耐药突变的遗传屏障都显著低于B亚型毒株,特别是PR区的V82T和RT区的G190S的遗传屏障差异最为显著。1.4我国CRF01＿AE毒株RT基因编码氨基酸的治疗相关耐药特征采用二项分布模型对入选的450条我国CRF01＿AE毒株的接受治疗者序列和1374条未治疗者序列各位点的突变频率进行统计分析。在药物的选择压力下,治疗者的病毒RT区的氨基酸突变数量和种类均大幅增加,序列的多态性特征更趋复杂,本研究共发现治疗者毒株序列在46个RT区突变位点上的突变频率显著高于未治疗者,是我国CRF01＿AE毒株的治疗相关突变位点。其中的17个位点的突变率变化虽然提示可能与抗病毒治疗相关,但上述位点在各耐药评价系统中均未有明确的注释,提示在药物的选择下毒株可能存在新的耐药相关突变位点。1.5我国CRF01＿AE毒株的治疗相关突变存在明显的亚型特异性通过比较两种亚型毒株在治疗前、后各位点突变率的变化幅度,发现我国CRF01＿AE毒株在RT区的12个位点的治疗前、后突变率差异明显大于美国B亚型毒株,其中101、138、179和190位为已知的耐药相关突变位点。1.6新耐药突变位点间及与已知耐药位点的作用分析为探索我国CRF01＿AE毒株治疗相关的突变位点特别是新的治疗相关位点与目前已知的耐药突变间是否存在关联,我们采用生物信息学的分析策略对数据进行统计分析。基于选择压力原理设计的Cor Mut软件计算的结果显示,对于11个新增的治疗相关位点突变,Y181C和L228R的作用关系最为密切,K65R和S68G以及E28K与K101E间存在协同式的作用模式,说明我国CRF01＿AE毒株可能存在其他的或更为复杂的突变间的相互作用。2、我国CRF01＿AE毒株耐药相关新位点的表型耐药研究2.1突变株的基因型和假病毒表型耐药检测结果由第一部分的研究结果,我们选择L228R突变作为本部分的研究靶点。入选5例临床抗病毒治疗失败者的耐药毒株进行基因型和假病毒表型耐药检测,结果显示多数抗病毒药物的基因型和表型耐药检测的结果基本一致,仅在含K65R突变株对于TDF的结果非常不一致,K65R突变株对于TDF的敏感性显著上升,表现为敏感或中度耐药。此外,K65R/M184V突变株对d4T和dd I的表型耐药检测结果均为敏感,而基因型耐药检测的结果则均为高度耐药。2.2耐药株和回复突变株的假病毒表型耐药检测结果比较本研究重点针对L228R对于毒株耐药的作用进行了揭示和分析,选取2例携带L228R突变的抗病毒治疗失败者的耐药毒株进行实验研究,比较耐药株及其突变回复株的表型耐药检测结果。结果显示,毒株对于NNRTIs和NRTIs的敏感性均发生一定的变化,特别是对于3TC和EFV,耐药株在回复L228R后其耐药性下降十分显著,并且两个携带L228R的耐药毒株具有类似的耐药突变模式,在回复L228R后也都出现一致的敏感性改变,说明L228R会显著提高耐药株对两类抗病毒药物的耐药性的判断是可靠的。结论:1、我国CRF01＿AE毒株pol基因编码氨基酸存在大量的自然多态性,其中在14个已知耐药相关突变位点存在亚型特异性多态性且多为次要耐药突变;而CRF01＿AE毒株pol基因特征可能对耐药株进化的遗传屏障产生一定影响。2、我国CRF01＿AE毒株治疗后可能存在新的耐药相关突变及亚型特异性耐药突变,其中一些突变与已知耐药相关突变存在密切关联性,如L228R与Y181C间具有强的作用关系,而S68G与K65R及E28K与K101E间则以相互协同的方式对毒株耐药产生影响。3、L228R是CRF01＿AE毒株的NRTIs和NNRTIs药物相关耐药辅助突变,与已知耐药突变K65R和Y181C共同出现时,使CRF01＿AE毒株对3TC及EFV的耐药性显著提高。