【摘 要】
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研究目的骨化纤维瘤（ossifying fibroma,OF）和纤维结构不良（fibrous dysplasia,FD）是两种临床病理特征常常重叠的颌骨纤维性病损,因二者的病变性质不同,临床处置的方法也不同,故两种疾病的鉴别诊断十分重要。本文应用激光显微切割技术,从形态学关联的微切样品中提取微量DNA和RNA进行精准的基因组拷贝数变异和转录组分析,旨在揭示OF与FD的差异,为二者的鉴别诊断以及精准
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研究目的骨化纤维瘤（ossifying fibroma,OF）和纤维结构不良（fibrous dysplasia,FD）是两种临床病理特征常常重叠的颌骨纤维性病损,因二者的病变性质不同,临床处置的方法也不同,故两种疾病的鉴别诊断十分重要。本文应用激光显微切割技术,从形态学关联的微切样品中提取微量DNA和RNA进行精准的基因组拷贝数变异和转录组分析,旨在揭示OF与FD的差异,为二者的鉴别诊断以及精准治疗提供新思路。研究方法1.收集临床上疑似或初步诊断为颌骨OF或FD的新鲜手术标本,一部分经快速浸润液氮后立即置于-80℃低温保存;另一部分在临床上进行常规甲酸脱钙（40%甲酸,颌骨肿瘤脱钙至变软即可,约5-7天）、制备石蜡样本。整理并系统评估上述收集病例的临床、影像、病理学资料,由三位病理学专家复习切片,依据2017年世界卫生组织头颈部肿瘤分类的相关标准将确诊病例纳入本研究,共计29例OF和28例FD;提取FD患者冰冻组织DNA,采用PCR扩增GNAS基因的8号和9号外显子,Sanger测序法检测GNAS基因突变。2.显微形态学关联的基因组拷贝数变异（copy number alteration,CNA）和转录组分析:应用激光显微切割测序对患者的冰冻组织进行多位点取材,从而获得具有形态学和准确空间位置信息的样本;应用直接核酸裂解、Tn5转座酶/SMART-seq2逆转录方案及磁珠纯化方案完成高纯度DNA/cDNA文库的构建;高通量测序分析两种疾病间基因组和转录组学差异。3.通过CNA和RNA-seq综合分析,筛选出可能导致OF致病的靶基因,并提取冰冻组织DNA,对筛选基因进行qPCR扩增验证。4.结合OF和FD拷贝数变异的结果进行临床病理学综合分析。结果1.本研究首次通过CNA分析揭示了 OF和FD基因组拷贝数变异的分子图谱,结果表明OF病例中可重复拷贝数变异的发生率（44.8%,13/29）显著高于FD病例（3.6%,1/28）,OF和FD的基因组CNA的发生率存在显著差异（p<0.001）。发生拷贝数变异的OF病例中,69%（9/13）的病例发生了 7号和12号染色体拷贝数部分扩增或缺失。2.通过进一步的CNA分析和qPCR验证,该研究在OF病人中明确了 8个与其频发 CNA（7 号和 12 号染色体）相关的基因（HILPDA,CALD1,C1GALT1,MICALL2,PHF14,AIMP2,MDM2和CDK4）扩增。此外通过RNA-seq分析发现上述8个基因在OF中表达也是上调的,基因扩增与基因表达之间具有一致性,提示CNA扩增可能影响了基因的表达。3.通过对FD和OF病人进行系统的临床病理分析并结合CNA分析结果表明:OF和FD的发病年龄（p=0.043）和发病部位（p<0.001）存在统计学差异,CNA的发生与OF的年龄、性别、发病部位及组织学亚型无相关性。该研究对一例在组织病理学上与FD有相似特征、但未发生GNAS基因突变的颌骨病损的病变组织进行CNA检测,结果发现其表现在OF中频发的12号染色体扩增,该分子检测结果辅助病理医生对该病例OF的诊断。此外,该研究还报告一例三次在我院进行手术治疗的可疑是OF恶变的病例,前两次诊断为OF但伴细胞增生活跃,第三次手术标本中因有明确浸润和细胞异型性,故诊断为骨肉瘤恶变,但通过对其三次手术标本组织进行的CNA分析与比较,发现三个时间点的CNA模式几乎相同,这提示该病损可能原发时就可能是低级别骨肉瘤,通常后者有可能与细胞丰富、生长活跃的OF难以从形态学上鉴别。结论本课题对OF和FD的基因组稳定性进行了分析,结果表明OF和FD的基因组拷贝数变异存在显著差异,在OF中CNA改变较FD更为常见。7号和12号染色体拷贝数部分扩增和缺失是OF患者中具有较高特异性且重复发生的关键分子事件。总之,颌骨纤维骨性病变的CNA和RNA-seq分析可以大大改善OF和FD之间的鉴别诊断,可以用作鉴别交界性病变或具有恶性潜能的病变的重要工具,并有助于预测疾病的进展。
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