【摘 要】
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登革病毒(dengue virus)是人类登革热(DF)、登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)的病原体。登革病毒感染严重威胁全球近半数人的健康,然而时至今日仍然没有有效的治疗药物和
【出 处】
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中国人民解放军军事医学科学院 解放军军事医学科学院
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登革病毒(dengue virus)是人类登革热(DF)、登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)的病原体。登革病毒感染严重威胁全球近半数人的健康,然而时至今日仍然没有有效的治疗药物和疫苗,因而探索抗登革病毒感染的新策略成为当今登革研究的热点。登革病毒非结构蛋白NS3,其编码基因在黄病毒中具有高度的保守性,基因全长1854bp,编码618个氨基酸,是病毒编码的第二大蛋白。NS3是一种多功能蛋白,N端具有Ser蛋白酶活性,C端具RNA解旋酶及NTPase、5′RNA三磷酸酶等活性,参与病毒前体的加工和病毒RNA的复制及基因组RNA的5′端加帽。该蛋白具有很好的免疫原性,并存在特异性CD4~+和CD8~+识别表位,可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。鉴于NS3同时具有病毒复制所必需的多种酶活性及其良好的免疫原性,其已成为登革抗病毒药物设计的重要靶标。本研究工作分为以下三个部分: 1) DEN NS3表达体系的构建: 提取感染登革2型病毒的C6/36细胞总RNA,RT-PCR扩增目的基因,双酶切后连入表达载体,构建重组表达载体pET32a-NS3、pET28a-dNS3,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达蛋白。通过优化诱导表达条件,NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域(dNS3)在大肠杆菌中获得可溶性表达。 2) 重组蛋白NTPase活性和抗原性分析: 表达产物经亲和层析纯化,超滤浓缩脱盐,孔雀绿钼酸铵法检测NTPase活性。纯化产物经测定具有良好的NTPase活性及抗原性,dNS3对其底物(ATP、CTP、GTP、UTP)存在不同的底物亲嗜性。体外条件下,发现登革2型病毒非结构蛋白NS5(RDRP)及polyA对dNS3的ATPase活性有促进作用,提示在病毒复制时,NS3与NS5间的相互作用可能对NS3的NTPase活性有调控作用。
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