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赤霉素(Gibberellin, GA)是一类能够促进植株生长的植物激素,在种子萌发、下胚轴和茎的伸长、叶片扩张、生长时期转变、花粉成熟和开花等过程中发挥重要的作用。在赤霉素信号转导通路中,DELLA蛋白作为关键的转录抑制因子阻遏了几乎所有已知的依赖GA的过程。虽然在分子水平上,DELLA蛋白已经被证明存在磷酸化和去磷酸化两种状态,并且丝氨酸/苏氨酸位点去磷酸化是DELLA蛋白降解所必需的。但是到目前为止,拟南芥中既没有找到磷酸化DELLA蛋白的激酶,也没有找到去磷酸化DELLA蛋白的磷酸酶。而且,在遗传学水平上,不同的磷酸化修饰对DELLA蛋白功能和稳定性的影响也是知之甚少。为进一步研究DELLA蛋白是否可以被磷酸化/去磷酸化修饰,以及保守的丝苏氨酸位点突变是否会影响RGA(REPRESSOR OF gal-3)蛋白的功能和稳定性,本研究通过酵母双杂交、pull-down、免疫共沉淀、点突变以及转基因技术在分子水平和遗传学水平展开DELLA蛋白的去磷酸化研究,得到的结论如下:1、TOPP4与DELLA蛋白相互作用。体外实验和体内实验证明了蛋白磷酸酶 TOPP4 (Type one protein phosphatase 4)能够与 DELLA 蛋白相互作用。并且初步验证与RGA和GAI (GIBBERELLIC ACID INSENSITIVE)蛋白相互作用的结构域在的C端。2、TOPP4去磷酸化RGA、GAI蛋白。RGA和GAI蛋白经碱性磷酸酶和原核重组表达的TOPP4处理后,电泳条带迁移速率变快,证明TOPP4能够将DELLA蛋白RGA和GAI去磷酸化。3、TOPP4介导了 DELLA蛋白RGA和GAI的降解。topp4-1中DELLA蛋白积累,植株矮化。过表达TOPP4的转基因植株35S:TOPP4中DELLA蛋白含量降低,植株的高度、叶面积、花序等方面表现出变高、变大的表型。4、模拟持续去磷酸化的RGA能够激活GA信号,在GA处理时不稳定。拟南芥Col-0中过表达模拟去磷酸化RGA,转基因植株在叶片大小、植株高度、开花时间、花数目、雌蕊和果荚长度、育性和下胚轴对GA和PAC的敏感性等方面,表现出与DELLA蛋白缺失突变体类似的GA过量表型。这些表型的产生原因可能是由于模拟去磷酸化的RGA保持它转录激活子活性,能够诱导GA合成基因的表达;但是失去了转录抑制因子的活性,不能阻止GA应答基因表达引起的。此外,模拟去磷酸化的RGA蛋白比野生型RGA蛋白不稳定、易降解,说明去磷酸化是RGA蛋白降解所必须的。5、模拟持续磷酸化状态的RGA抑制了 GA信号,在GA处理时蛋白稳定,不易降解。过表达模拟磷酸化的RGA引起植株表现类似GA缺陷和有着不降解RGA突变体的表型,如矮化、颜色深绿和不育。这些表型的产生可能是由于模拟磷酸化的RGA不能够诱导GA合成基因表达,但能够抑制GA应答基因的表达导致。此外,模拟磷酸化的RGA蛋白稳定且几乎不降解,加剧了 RGA在GA信号中的抑制作用。并且研究还发现,不降解的RGA对植株育性的影响在Col-0生态型中比在Ler生态型中更加显著。总之,本研究的生化和遗传学分析表明,DELLA蛋白能够被磷酸酶TOPP4去磷酸化,并且可能通过6个保守的丝氨酸/苏氨酸位点磷酸化/去磷酸化修饰调控了 DELLA蛋白的功能和自身稳定性。