基于钙离子结合蛋白（recoverin）在结合钙离子（Ca2+）前后构象变化的特点，运用计算机模拟设计谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）催化中心，成功将recoverin别构效应与GPx酶催化功能相关联。通过结构分析Ca2+调控下模拟酶催化位点的“开关”状态，并研究活性“开启”状态下野生型recoverin及其突变体与GPx天然底物谷胱甘肽（GSH）的分子识别机制，为设计构筑高效智能抗氧化硒酶的定点突变实验提供理论指导。主要研究工作包含以下两个部分：1.基于分子对接设计钙离子响应的GPx模拟酶细胞受活性氧(ROS)攻击所产生的氧化损伤程度与细胞质中释放的钙离子浓度之间存在着密切联系。受此启发，以钙离子调控的变构蛋白recoverin作为分子骨架，设计智能响应ROS浓度变化的GPx模拟酶具有较好的应用前景。首先，将recoverin与GSH进行分子对接研究，虚拟筛选recoverin变构区域与GSH结合的低能垒识别模式，并依据底物GSH特异性识别后其巯基基团与催化中心硒原子的空间定向原理，确定催化残基硒代半胱氨酸（Sec）的拟修饰位点。随后，通过模拟分析recoverin结合Ca2+前后修饰位点的构象变化，揭示模拟酶催化基团Sec的“开关”状态与蛋白别构效应的关系。此外，基于对活性“开启”时的recoverin-GSH复合物结构的分析，还可研究识别过程中关键氨基酸残基的组成和部分弱相互作用如氢键和表面静电作用对于底物识别的影响，为设计构筑Ca2+响应的人工智能硒酶的实验奠定理论基础。2.分子动力学结合自由能计算研究模拟酶与底物的识别机制理论研究recoverin与GSH识别过程中酶-底物复合物的动态结构、热力学稳定性以及关键氨基酸残基的识别作用力贡献，对于揭示该智能GPx模拟酶的分子识别机制，进一步改进其催化效率具有非常重要的指导意义。基于上一工作中野生型recoverin与底物GSH的分子对接结果，本工作深入研究了突变位点Q50R、A64G、H68N对于recoverin-GSH识别的影响。即运用分子动力学模拟结合自由能计算详细分析了WT-recoverin、单位点突变型（recoverin-Q50R、recoverin-A64G、 recoverin-H68N）、双位点突变型（recoverin-Q50R/A64G、recoverin-A64G/H68N、 recoverin-Q50R/H68N）及三位点突变型(recoverin-Q50R/A64G/H68N)共八组蛋白与GSH复合后结构随模拟时间的变化及其相应的热力学参数，包括结合自由能变化（ΔG），焓变（ΔH）和熵变（ΔS）。通过结构与能量数据的对比，结合表面静电势计算的电荷分布情况，理论预测野生型和各突变型recoverin与GSH之间结合强度，判断其复合物的稳定性。进一步利用结合自由能能量分解计算，揭示了其识别过程是焓驱动，并以范德华相互作用力为主导，多种弱相互作用力如氢键、疏水相互作用和静电相互作用协同的结果。随后，再经活性中心各氨基酸残基能量分解计算，研究关键氨基酸残基Arg50和Gly64对识别作用力的贡献，确定了影响蛋白-底物识别的主要因素。最终将基于上述分析结果，获得突变对底物GSH识别的有效性和选择性信息。这些研究结果将有助于实验上合理改进GPx模拟酶的底物结合特异性，提升其催化效率。