脯氨酰内肽酶（PEPs）是重要的蛋白酶,可将蛋白质水解为C端是脯氨酸的生物活性肽,该活性肽可用于治疗乳糜泻病。因此,对脯氨酰内肽酶催化性能进行研究,具有重要意义。大量研究表明脯氨酰内肽酶催化效率提升具有很大潜力,然而,目前很少有研究通过理论计算来改造脯氨酰内肽酶的催化效率,进而加强其在食品工业加工和治疗方面的研究与应用。本研究选择性质优异的来源于嗜热链球菌Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶进行异源表达、纯化,并对其酶学性质进行了探究,结果表示该酶的最适pH为6.6,最适温度为63°C,其对九肽底物SEKTTMPLW的比酶活为11.99 U/mg,酶促反应动力学参数K_M值为7.48 mM,k_cat值为164.47 min^-1,k_cat/K_M值为22 min^-1·mM^-1。此外,本课题开发了一种基于完美构象的全新计算机理性设计方法,从脯氨酰内肽酶的催化机理入手,以催化位点Ser的O原子与底物Pro的C原子之间的距离作为增加脯氨酰内肽酶对底物的催化活性的“近进攻态”构象的标准。首先通过同源建模、分子对接、MD模拟等获得酶-底物的稳定复合物结构,通过约束分子动力学（MD）模拟迅速获得了“近进攻态”构象,能量最小化获得了575个酶与底物的结合自由能,然后快速虚拟筛选出9个定点突变。实验结果表明I462W和Q560Y两个突变体的k_cat/K_M值相比于野生型分别增加了32.7%和6.3%。上述结果表明本课题开发的全新理性设计方法可有效提高脯氨酰内肽酶的催化活性。