【摘 要】
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研究背景:神经母细胞肿瘤（Neuroblastoma,NB）具有显著的异质性,预后与确诊年龄、肿瘤分期、组织学类型及遗传学改变相关。部分IVs期患儿具有自发消退倾向,而高危组即使给予多学科联合强化治疗仍难以治愈,长期生存率不足50%。目前研究认为,NB细胞具有肾上腺素能型（ADRN型）及间充质型（MES型）两种亚型,这两种表型具有不同的分化程度及药物敏感性,深入研究NB的细胞异质性对于指导精准治疗
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研究背景:神经母细胞肿瘤（Neuroblastoma,NB）具有显著的异质性,预后与确诊年龄、肿瘤分期、组织学类型及遗传学改变相关。部分IVs期患儿具有自发消退倾向,而高危组即使给予多学科联合强化治疗仍难以治愈,长期生存率不足50%。目前研究认为,NB细胞具有肾上腺素能型（ADRN型）及间充质型（MES型）两种亚型,这两种表型具有不同的分化程度及药物敏感性,深入研究NB的细胞异质性对于指导精准治疗和改善患儿预后具有重要意义。然而,现有的细胞异质性研究依赖于细胞群体水平的转录组测序技术,仅能反映细胞整体的转录组特征,掩盖了细胞丰度相对较低的细胞的特征（例如肿瘤干细胞）。因此,迫切需要对NB开展单细胞水平的转录组学研究,以进一步明确非遗传性异质性及NB细胞表型可塑性的调控机制。本课题旨在通过单细胞转录组测序技术,分析神经母细胞瘤在单细胞水平的瘤内和瘤间异质性,识别预后不良相关基因。研究方法:1.神经母细胞瘤的肿瘤原发灶的异质性分析:收集7例具有不同病理亚型的神经母细胞瘤的肿瘤原发灶,通过流式细胞分选捕获单个有核的活细胞（Calcein-Blue+/DRAQ5+）,采用Smart-seq2方法构建单细胞c DNA文库,对符合质控的5309个细胞进行生物信息学分析。2.循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells,CTCs）的数目与NB转移和进展的相关性研究:收集20名健康儿童和25名未经治疗的NB患儿的静脉血,运用CD56免疫磁珠富集结合免疫荧光鉴定的方法,识别外周血中循环肿瘤细胞（DAPI+/GD2+/CD45-）。分别在NB患儿两个疗程化疗后和常规化疗结束时再次进行CTCs检测,同时随访并收集患儿的临床资料,评估CTCs数目与治疗反应和预后之间的相关性。3.高危NB患儿的循环肿瘤细胞的异质性研究:收集2名健康儿童和3名高危NB患儿初诊时外周血,通过免疫磁珠阴性富集结合流式分选的方法捕获单个有核的非白活细胞（Calcein-Blue+/DRAQ5+/CD45-）,采用Smart-seq2方法构建单细胞c DNA文库,对符合质控的305个细胞进行生物信息学分析。研究结果:1.神经母细胞瘤的肿瘤原发灶的异质性分析:共识别1429个NB细胞和3880个非肿瘤细胞。根据NB细胞的转录组特征进行分类,识别到1000个ADRN型NB细胞,214个过渡型NB细胞,215个MES型NB细胞。细胞状态转变轨迹研究结果显示,ADRN型NB细胞具有双向分化轨迹,即可以向过渡型NB细胞或MES型NB细胞转变。过度型NB细胞呈现侵袭性的神经发育表型,与患者的预后不良相关。2.循环肿瘤细胞数目与NB转移和进展的相关性研究:20名健康儿童静脉血CTCs检测结果为阴性,25名NB患儿初诊时CTCs的检出率为84%。治疗后发生NB进展的患儿在初诊时CTCs数目更多（P=0.015）、血清NSE水平更高（P=0.010）。同时,这部分患儿在两个疗程化疗后CTCs的阳性检出率更高（P=0.028）。初诊时,CTCs数目≥11个/3m L的NB患儿的无进展生存时间较短（19.4个月vs.32.5个月,P=0.007）。3.高危NB患儿的循环肿瘤细胞表型异质性研究:从2名健康儿童和3名未经治疗的高危NB患儿外周血中捕获到274个CTCs和31个非肿瘤细胞,经过数据降维和聚类后形成3个CTCs细胞簇（Clusters）和1个非肿瘤细胞簇。拷贝数改变分析结果显示CTCs具有NB特征性拷贝数改变（17q+/1p-/11q-）。高危NB患儿的CTCs共同上调141个基因,主要参与氧化磷酸化和NADH脱氢酶复合物。大部分CTCs为ADRN型NB细胞,一小部分CTCs为细胞分裂活跃、差分化的MES型NB细胞,后者与NB患儿预后不良相关。结论:1.NB存在广泛的细胞异质性,包括瘤内异质性及瘤间异质性。2.在NB的原发灶中存在过渡型NB细胞,具有侵袭性神经发育表型,与患者的不良预后及MYCN基因扩增、肿瘤转移相关。3.初诊时CTCs数目与NB进展和转移相关。4.CTCs具有表型异质性,其中细胞分裂活跃、差分化的间充质型CTCs与NB患儿预后不良相关。
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