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核酸胞嘧晻修饰(5-methylcytosine,5-mC)参与许多生物学过程,是一种重要的表观遗传修饰。研究表明5-mC具有调控基因表达等重要生理功能,因此5-mC在DNA和RNA中的含量分布受到严格控制。除了甲基转移酶调控DNA和RNA的甲基化水平外,由核酸分解代谢而来的甲基化核苷酸也有可能在DNA的复制或RNA的转录过程中随机加入。为了避免这些甲基化的核苷酸重新插入到DNA或RNA中造成的不利影响,由核酸分解代谢而来的5-甲基脱氧胞嘧啶核苷酸(5-Me-dCMP)能在脱氨酶的作用下脱去氨基变成正常的胸腺嘧啶核苷酸(TMP),从而消除其可能的细胞毒性。基于细胞中存在脱氨酶可以将甲基化核苷酸转化为TMP,研究者普遍认为不存在内源性的5-Me-dCMP和5-甲基胞嘧啶核苷酸(5-Me-CMP)。在本文的研究中,我们建立了基于化学衍生结合液相色谱-质谱联用的分析方法用来分析核苷酸。化学衍生可以大大提高核苷酸的检测灵敏度,通过这种方法,我们成功的检测到包括5-Me-dCMP和5-Me-CMP在内的10种核苷酸的检测。工作的主要内容如下:我们利用氨基硅胶小柱,选择性的富集尿样、组织、培养细胞中的核苷酸,通过氨基硅胶小柱的富集,大部分的基质可以被除去,而且核苷酸的回收率很高(88.3%以上),利用该方法,我们能在尿样、组织、培养细胞中检测到部分正常核苷酸,但因为甲基化修饰的胞嘧啶核苷酸含量低,因此后续直接质谱分析不能检测到 5-Me-dCMP 和 5-Me-CMP。为了提高核苷酸的检测灵敏度,我们用氮氮二甲基对苯二胺(N,N-dimethyl-p-phenylenediamine,DMPA)对氨基硅胶小柱富集到的核苷酸进行衍生。由于衍生化试剂中疏水的苯环基团和易带电的叔氨基团的引入,核苷酸的灵敏度提高了 88-372倍。利用建立的分析方法,发现内源性的5-Me-dCMP和5-Me-CMP在人体肾组织,尿样和培养细胞(293T细胞和HeLa细胞)中广泛存在。内源性5-Me-dCMP和5-Me-CMP的发现表明脱氨酶并不能将所有甲基化的胞嘧啶核苷酸脱去氨基,这些残留的甲基化核苷酸可能会进一步转成三磷酸核苷酸,进而在DNA复制和RNA转录时加入到DNA和RNA中。另外,与正常人相比,我们发现5-Me-dCMP和5-Me-CMP在肾癌组织、淋巴癌尿样中的含量显著性降低,暗示这些甲基化修饰的胞嘧啶核苷酸被更多的插入到DNA或RNA中。该研究工作显示5-Me-dCMP和5-Me-CMP可能在癌症的调控中扮演着一定的功能。