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原发性乳腺癌(Breast cancer)是我国女性最常见的恶性肿瘤。目前治疗手段包括手术、放化疗、内分泌及靶向治疗等。中医学认为乳腺癌主要由于脏腑亏虚、痰瘀闭阻,毒邪郁滞所致。而中晚期肿瘤患者常存在气虚血瘀证,应以益气活血解毒法治疗。基于益气活血解毒法的固本抑瘤Ⅱ号是首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科治疗气虚血疲证恶性肿瘤患者的临床有效方剂,常配合化疗使用。既往研究提示固本抑瘤Ⅱ号能在一定程度上抑制肿瘤细胞生长,诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,可能还存在非凋亡性死亡机制,与自噬有关。近期研究显示,自噬在乳腺癌发生、发展及乳腺癌细胞对放化疗的反应中扮演了重要角色。因此,研究自噬在乳腺癌中的作用对治疗有重要意义。为进一步探讨固本抑瘤Ⅱ号的抑瘤机制,本实验选用人乳腺癌细胞MCF-7,将固本抑瘤Ⅱ号根据各治法进行拆方,观察全方及各拆方成分对人乳腺癌MCF-7细胞及裸鼠移植瘤生长的影响,以及对裸鼠移植瘤组织凋亡及自噬情况的影响,探讨固本抑瘤Ⅱ号抑制乳腺癌细胞生长的部分作用机制。第一部分 固本抑瘤Ⅱ号及拆方对乳腺癌MCF-7细胞生长的影响及自噬现象观察目的:探讨固本抑瘤Ⅱ号全方及各治法拆方补益、活血、解毒组药物成分对人乳腺癌MCF-7细胞生长的影响,观察全方、补益、活血、解毒组各拆方诱导的人乳腺癌MCF-7细胞自噬现象。方法:制备固本抑瘤Ⅱ号全方(Q)、补益(B)、活血(H)、解毒组(J)含药鼠血清。采用MTT法检测20%、10%、5%浓度的固本抑瘤Ⅱ号及各拆方含药血清对人乳腺癌MCF-7细胞增殖情况的影响;应用免疫蛋白印迹法及免疫荧光法检测自噬标志性蛋白LC3的表达情况。结果:20%浓度含药血清:全方、活血、解毒组抑制率较高(27.39%、24.97%、16.83%)。10%浓度含药血清:固本抑瘤Ⅱ号全方及补益、活血、解毒组成分均能在一定程度上抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,全方、活血组抑制率较高(7.08%、10.17%)。5%浓度含药血清:全方、活血、解毒组作用24h后能抑制人乳腺癌MCF-7细胞生长,但抑制率较低,而补益组作用24h后促进人乳腺癌MCF-7细胞增殖。10%浓度含药血清作用6h、12h后,全方、补益、活血、解毒组人乳腺癌MCF-7细胞自噬标志性蛋白LC3表达均较对照组增多,提示人乳腺癌MCF-7细胞出现自噬现象(P<0.05)。10%浓度含药血清作用24h后,全方、补益、活血、解毒组的乳腺癌细胞均有自噬现象发生,活血组自噬水平与12h相似,活血、解毒组自噬水平较高,应用自噬抑制剂3-MA后各组自噬水平均有下降。10%浓度含药血清作用6h、12h后,全方、补益、活血、解毒组自噬标志性蛋白LC3Ⅱ条带逐渐增粗,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高,但无统计学差异(P>0.05)。10%浓度含药血清作用24h后,全方、活血组LC3Ⅱ/Ⅰ比值大于1,且活血组较前明显升高,自噬水平较高(P<0.05)。结论:固本抑瘤Ⅱ号全方、活血、解毒组的10%、20%浓度含药血清能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖。一定浓度的固本抑瘤Ⅱ号及各拆方组含药血清可诱导人乳腺癌MCF-7细胞产生自噬,但各组诱导的细胞自噬水平不同,自噬抑制剂3-MA能够抑制固本抑瘤Ⅱ号全方和各拆方组所诱导的细胞自噬发生。全方、活血组诱导的人乳腺癌MCF-7细胞自噬水平较高,可能参与了抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用。第二部分 固本抑瘤Ⅱ号及拆方对MCF-7裸鼠移植瘤的干预作用及其诱导的自噬与相关通路研究目的:观察固本抑瘤Ⅱ号全方及补益、活血、解毒各拆方组对人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生长的影响及其诱导的自噬,观察各组对自噬相关PI3K信号通路的影响。方法:应用人乳腺癌MCF-7细胞建立裸鼠移植瘤模型,固本抑瘤Ⅱ号全方组(Q)6.56g/ml,补益组(B)3.50g/ml、活血组(H)1.65g/ml、解毒组(J)1.40g/ml 给药 28天后,测量移植瘤体积、瘤重,应用TUNEL法检测细胞凋亡情况、免疫组化法检测自噬标志性蛋白LC3的表达,免疫印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl-2、LC3Ⅰ、Ⅱ以及自噬相关信号通路PI3K/Akt/mTOR的蛋白表达水平。结果:与对照组移植瘤相比,全方、活血组移植瘤体积均变小(832.33±176.99 mm3、724.39±105.26mm3)。与对照组相比(0.79±0.39g),全方组瘤重减少 39.10%(0.75 ±0.68g),活血组瘤重减少54.74%(0.36±0.1g)(P<0.05)。全方组、活血组凋亡指数有明显增加(6.96 ± 0.88%,15.26±4.95%)(P<0.05)。与对照组相比,全方组和活血组抗凋亡蛋白Bcl-2表达均有下降,活血组较明显(P<0.05),全方、活血组自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ比例均升高(1.09±0.06、1.05±0.05),全方、活血组Akt表达无明显差异,活血组p-Akt表达、p-mTOR、mTOR表达下降(P<0.05)。结论:固本抑瘤Ⅱ号全方组(Q)和活血组(H)在一定程度上抑制人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长。全方、活血组能够诱导乳腺癌组织发生细胞凋亡及自噬。固本抑瘤Ⅱ号的活血组成分通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导细胞自噬,可能与凋亡协同作用抑制人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤的生长。