冠心病的致死致残率很高，在我国其发病率呈逐年上升趋势。经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)是治疗动脉粥样硬化引起的冠脉血管狭窄的主要手段之一，而高达20-50％的再狭窄是影响该手术疗效的主要因素。基于导管将基因准确地送至狭窄血管的局部，进行基因治疗，是预防血管再狭窄较有效的方法之一。而选择合适的基因和载体是基因治疗再狭窄的关键之一。目前，针对再狭窄的发病机制主要从以下方面选择基因：1．抑制血管平滑肌细胞的增生和迁移的基因；2．防止血栓形成的基因；3．促进再内皮化的基因。病毒载体多选用腺病毒和腺病毒伴随病毒。单基因治疗很难同时兼顾上述几方面的需求，故本研究采用双基因共表达策略，分别以细胞周期负调控因子P21基因和反义凝血酶受体基因(ATR)，及P21和细胞外基质金属蛋白酶组织抑制因子-4(TIMP-4)基因配合，拟从抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增生、迁移入手，探讨双基因共表达预防再狭窄的新途径。 一、携带p21和ATR单、双基因的AAV载体的构建与包装 目的 构建、包装携带p21和ATR单、双基因的重组腺病毒伴随病毒载体(rAAV)，为进一步的体内、外功能实验提供基础。 方法构建携带p21和ATR单、双基因的腺病毒伴随病毒(AAV)载体质粒及携带报告基因—绿色荧光蛋白(GFP)基因的AAV载体质粒。上述质粒经Lipofectamine介导转染BHK-21，再经G418筛选、挑选G418抗性细胞克隆，即得到嵌合有上述载体，并能稳定表达载体所携带基因的细胞株。提取各细胞株的基因组DNA，经相应的内切酶酶切后，进行Southern Blot杂交分析转基因结果。显微镜下观察报告基因GFP在BHK细胞中的表达。用重组有AAV“cap-rep”基因的重组单纯疱疹病毒(HSV1-rc／ΔUL2)感染所得的细胞株，包装、纯化rAAV病毒。经倍比稀释、Dot Blot杂交，计算rAAV病毒的滴度。 一文移要 结果＊）经G4 18筛选AAV载体质粒转染的BHK细胞，得到整合有相应质粒载体的细胞株：BHK／ pZI、BHKjATR、BHK／AP和BHK／GFP，并且在 BHK／ pZI和 BHK／AP的基因组 DNA中检测出外源pZI基因片段的 Southern杂交信号，在 BHKjATR和 BHK／AP中检测出ATR的Southern杂交信号，表明AAV载体质粒己嵌合入BHK细胞基因组DNA。＊）转染质粒后第五天，在显微镜下即可观察到绿色荧光出现在BHK／GFP细胞中，之后荧光逐渐增强，表明GFP在BHKJGFP细胞中得到了稳定的表达。（）HSVIj／八 ULZ感染所得细胞，包装出携带相应外源基因的 AAV载体：rAAV…，rAAV／Ah，rAAVAP和 rAAV们FP。在 rAAV巾 和 rAAV／AP均检测出 pZI基因的杂交信号，在rAAV／AfR和 tM／AP均检测出ATR的杂交信号，表明所包装病毒含有目的基因。根据点杂交结果，计算出rAAV的滴度分另是：rAAV／fR＝二．25X 10“（Particles／ml），rAAV／ZI＝1．07X10u（particles／ml），rAAV／AP＝9．88X10“（particles／。l）。 结论1．AAV载体质粒PSNAV可将其所携带的基因转入BHK细胞，并嵌合入BHK细胞的基因组DNA，用于rAAV包装。2．绿色荧光蛋白基因可以在 BHK”FP细胞中充分表达。3．HSVI｛／凸 ULZ包装系统可以包装出大于 IX 10’‘＊丫articles／Inl的高滴度 rAAV病毒。二、P21和ATR双基因共表达对人主动脉平滑肌细胞的影响 目的 观察P21和 ATR双基因共表达对人主动脉平滑肌细胞uS肌）增殖和凋亡的影响。 方法 取7七月龄胎儿的主动脉，采用贴块法培养原代ASMC。用 杉含1015％胎牛血清的DMEM继续传代培养至5S代，然后用rAAV巾ZI，rAAV／AfR，rAAV／AP和 rAAVGFP分别感染，进行转基因实验。用荧光显微镜检测GFP的表达。于转基因后第7天收集ASMC，提取其总 RNA。经半定量 RTICR和 Northem杂交检测目的基因的表达。经MTT比色实验，绘制细胞生长曲线，检测细胞存活率。经PI染色、流式细胞分析检测细胞的凋亡。 结果 在转GFP基因的ASMC，于转基因后第5刁天即可在荧光 －2． 中文搏要 显微镜下观察到绿色荧光的出现，表明GFP在ASMC中获得了表达。 经半定量 RTICR、Northern杂交分析显示：（切 和 ATR已转人 ASMC 中并获得了表达。但在转单基因的细胞中，PZI基因表达量高于转双基 因细胞，其盯千CR扩增条带的灰度值之比是2．18：l．94。门）在转 ATR单、双基因的ASMC中 凝血酶受体基因（T）的表达量均受到抑 制，而且在转单基因的细胞中ATR对TR的抑制较强。凝血酶受体基因 的附－PCR扩增条带的灰度值分另是0．63和 l．01。经抑T卜色分析表 明，PZI和 ATR双基因共表达可使ASMC的细胞存活率下降 32．6～37．8 ％，大于 PZI或 ATR单基因对 ASMC生长的抑制作用（细胞存活率下降 18～22．5％人经流式细胞分祈表明，在转基因后的第 7大，rAAV儿F卜 rAAV／ATR、rAAV／p21和 rAAV／AP组的