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目的:化疗是肿瘤治疗的主要手段之一,大多数化疗药物是通过使肿瘤细胞DNA损伤或抑制有丝分裂而导致肿瘤细胞死亡[1]。但是在治疗过程中,一些肿瘤细胞适应这类DNA损伤时即产生化疗敏感性的降低[2]。肿瘤化疗耐药是肿瘤治疗过程中的难点问题,其原因主要是肿瘤细胞化疗敏感性降低的分子机制十分复杂。细胞凋亡是以DNA断裂、核固缩、细胞皱缩和质膜出泡为特征的细胞应激反应。诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物发挥抗肿瘤作用的重要机制之一[3]。叉头蛋白FOXK2是Forkhead box（FOX）转录因子家族中的一员,其蛋白由660个氨基酸组成。在结构上FOXK2与其它家族成员都具有一个高度保守的“叉头”和“翼型螺旋”DNA结合域[4]。FOXK2在细胞生存[5]、有氧糖酵解[6]、线粒体代谢[5]、自噬[7]等方面具有重要作用。有研究显示在胰岛素信号刺激下,敲减FOXK2可导致凋亡相关基因的上调[5]。有研究报道CDK1-cyclin B激酶复合体可磷酸化FOXK2的Ser368和Ser423位点,通过调控FOXK2蛋白稳定性抑制细胞凋亡[8]。还有研究表明,FOXK2通过调控表皮生长因子受体（EGFR）促进了肾透明细胞癌的凋亡[9]。最近的研究揭示,DNA损伤刺激下CHK2可磷酸化修饰FOXK1和FOXK2,致使肿瘤细胞提高自噬能力从而抑制其凋亡[10]。由此可见FOXK2蛋白本身及其磷酸化修饰都对肿瘤细胞的凋亡起重要作用,因此我们想探索FOXK2是否存在其他蛋白质翻译后修饰行为影响了肿瘤细胞的凋亡。蛋白质乙酰化修饰作为翻译后修饰的重要机制之一,对细胞周期、DNA损伤修复、代谢、凋亡和自噬等细胞活动起关键调控作用[11,12]。目前研究表明,FOXK2可通过磷酸化、SUMO化等翻译后修饰的方式调控细胞功能。但是,FOXK2的乙酰化修饰目前未见报道。本研究中我们首次发现FOXK2可被乙酰化修饰,其去乙酰化酶是SIRT1。去乙酰化酶Sirtuin家族在衰老相关疾病中扮演重要角色,其中SIRT1的去乙酰化酶活性是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖的。作为重要的长寿基因和去乙酰化酶,SIRT1在DNA损伤修复[13]、应激反应[14]、细胞周期[15]和线粒体代谢[16]方面都发挥了重要的翻译后修饰调控作用[17]。但是SIRT1调控FOXK2的去乙酰化修饰影响肿瘤细胞化疗敏感性的分子机制目前尚不清楚,这也是本研究拟解决的关键科学问题。我们猜测FOXK2的乙酰化状态很可能影响肿瘤细胞对化疗的敏感程度,这将为肿瘤的耐药治疗提供新思路和新靶点。方法:1、FOXK2乙酰化的研究。1.1利用免疫沉淀和Western blot技术探索FOXK2在细胞内是否可以被乙酰化修饰。1.2在细胞内外转过表达四种乙酰基转移酶,通过免疫沉淀和Western blot技术明确FOXK2的乙酰基转移酶;通过免疫共沉淀技术检测二者是否存在互作。1.3在细胞内外转过表达SIRT1,通过免疫沉淀和Western blot技术明确FOXK2的去乙酰基转移酶;通过免疫共沉淀技术检测二者是否存在互作;通过免疫荧光实验和共聚焦激光扫描显微镜检测二者在细胞内是否存在共定位。1.4应用免疫沉淀、Western blot和质谱分析技术明确FOXK2的乙酰化位点;利用分子克隆技术构建FOXK2乙酰化位点野生型和失活型的质粒;通过免疫沉淀和Western blot技术,分别在293T和H1299细胞中验证此位点对FOXK2乙酰化水平的影响。2、检测DNA损伤刺激下,SIRT1去乙酰化修饰FOXK2的分子机制。2.1 Cisplatin刺激下,利用免疫共沉淀和Western blot技术检测FOXK2与SIRT1的互作改变。2.2 Cisplatin刺激下,利用免疫沉淀和Western blot技术检测FOXK2的乙酰化改变。2.3 Cisplatin刺激下,利用蛋白质核浆分离、Western blot以及免疫荧光技术检测乙酰化位点野生型和失活型的FOXK2的核内分布改变。2.4 Cisplatin刺激下,利用免疫沉淀和Western blot技术检测FOXK2的乙酰化水平是否依赖于SIRT1去乙酰化酶活性。3、利用慢病毒感染技术构建H1299、HCT116和Hela稳定敲减FOXK2的细胞系,通过Western blot技术检测敲减效率;进一步在敲减细胞株的基础上构建回补FOXK2-WT和FOXK2-K223R的稳定过表达肿瘤细胞系,通过Western blot技术检测FOXK2乙酰化差异。4、检测FOXK2的乙酰化状态对肿瘤细胞化疗敏感性的影响。4.1化疗药物作用下,利用CCK-8细胞毒性实验检测sh FOXK2-ov NC、sh FOXK2-ov WT、sh FOXK2-ov K223R三组肿瘤细胞的存活差异。4.2化疗药物作用下,利用流式细胞凋亡技术检测sh FOXK2-ov NC、sh FOXK2-ov WT、sh FOXK2-ov K223R三组肿瘤细胞的凋亡差异。4.3化疗药物作用下,利用Western blot技术检测sh FOXK2-ov NC、sh FOXK2-ov WT、sh FOXK2-ov K223R三组肿瘤细胞Cleaved-PARP、Cleaved-caspase3蛋白的表达差异。4.4利用裸鼠成瘤实验,从体内水平检测sh FOXK2-ov WT和sh FOXK2-ov K223R两组肿瘤细胞化疗敏感性的差异。结果:1、FOXK2可被乙酰化修饰,其乙酰化酶是CBP,去乙酰化酶是SIRT1,并且FOXK2与CBP和SIRT1都存在蛋白质相互结合;共聚焦激光扫描显微镜显示FOXK2与SIRT1在核内存在共定位。2、质谱分析结果显示FOXK2的乙酰化位点是Lys223;成功构建FOXK2乙酰化位点野生型和失活型的载体质粒,并且在细胞内验证此位点失活型的FOXK2蛋白乙酰化水平明显降低。3、DNA损伤刺激下,FOXK2与SIRT1互作减弱,FOXK2乙酰化增强并且核内分布明显减少;免疫荧光实验结果显示乙酰化位点失活型的FOXK2在核内分布并未减少;FOXK2的乙酰化水平依赖于SIRT1去乙酰化酶活性。4、成功构建稳定敲减FOXK2的H1299、HCT116和Hela细胞系,敲减效率高;成功在稳定敲减FOXK2的基础上构建回补FOXK2-WT和FOXK2-K223R的稳定过表达肿瘤细胞系。5、化疗药物作用下,FOXK2促进了H1299、HCT116和Hela细胞的凋亡;FOXK2的乙酰化状态促进了H1299、HCT116和Hela细胞的凋亡,而乙酰化位点失活型的FOXK2（去乙酰化状态）可挽救肿瘤细胞的凋亡。结论:1、首次发现叉头蛋白FOXK2可被乙酰化修饰,SIRT1去乙酰化修饰FOXK2的位点是其第223位的赖氨酸。2、DNA损伤刺激下,FOXK2与SIRT1结合减弱,致使FOXK2乙酰化增强并且核内分布减少。3、FOXK2的乙酰化状态增强了肿瘤细胞的化疗敏感性,去乙酰化状态减弱了肿瘤细胞的化疗敏感性。我们的研究有望找到肿瘤耐药治疗的新靶点,为解决肿瘤化疗耐药性问题提供理论依据。