类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见自身免疫性疾病。RA在成年人中发病率约为0.5%-1%,年新发病例5-50例/10万人。RA具有一定遗传倾向,遗传可能性为40-65%。RA临床表现主要是多发性、对称性的关节肿痛、挛缩畸形和功能障碍。除此之外,RA常伴发多脏器系统性病变,对患者生命健康和生活质量有较大威胁。上世纪九十年代后期,研究人员在RA患者血清样本中发现一类新型自身抗体-抗瓜氨酸蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibodies,ACPA)。研究发现,该类抗体具有较好RA临床诊断特异性。ACPA的靶抗原是一类发生蛋白翻译后修饰(蛋白瓜氨酸化)而产生的瓜氨酸化抗原。通常,蛋白瓜氨酸化由肽精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase,PAD)催化实现。初步研究表明,ACPA可加剧RA慢性炎症的持续具有显著的致病作用。ACPA通过刺激单核巨噬细胞产生TNF-α等促炎细胞因子,促进炎性进展。ACPA可协同类风湿因子(rheumatoid factor,RF)加重炎症过程。白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是在先天性免疫应答过程中的关键炎症介质,并在慢性炎症病理进展中有重要作用。IL-1β在RA患者关节滑膜局部聚积,且在RA病情进展的各个阶段均明显升高。IL-1β主要通过炎性小体依赖的途径产生。炎性小体主要由炎性小体传感器分子(如NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)家族蛋白3(NLRP3)和NOD样受体家族蛋白C4(NLRC4)等),衔接蛋白即凋亡相关斑点样蛋白(ASC)以及胱天蛋白酶1(Caspase 1)组成。在RA研究最常见的类型是NLRP3炎性小体。NLRP3炎性小体在RA中高度表达;RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中NLRP3炎性小体相关基因(ASC,NLRP3-FL,NLRP3-SL和CASP1基因)表达升高。此外,作为RA发病重要危险因素,非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶22(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 22,PTPN 22)可对NLRP3炎性小体活化进行调节。然而,RA患者体内ACPA是否能刺激单核巨噬细胞产生IL-1β目前尚无深入研究。本研究主要分三部分进行。第一部分:ACPA活化巨噬细胞NLRP3炎性小体诱导IL-1β产生。通过对ACPA阳性RA患者,ACPA阴性RA患者和骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者关节滑膜组织免疫组化染色(immunohistochemical staining,IHC staining)发现,ACPA阳性RA组患者IL-1β水平升高。为对该现象在离体水平进行研究,我们使用患者血清纯化的ACPA直接刺激PBMC来源的巨噬细胞并检测培养基中的IL-1β水平。结果表明,ACPA刺激巨噬细胞以时间和剂量依赖性方式产生IL-1β。进一步研究发现,干涉NLRP3分子IL-1β产生减少。该结果表明,ACPA通过活化巨噬细胞NLRP3炎性小体促进IL-1β产生。通过对RA患者滑膜组织中CD147和NLRP3表达水平分析,我们发现在ACPA阳性RA患者中NLRP3和CD147表达均增加且二者表达程度高度正相关。体外实验表明,ACPA刺激慢病毒干涉CD147的巨噬细胞IL-1β产生显著减少。与对照细胞相比,干涉CD147的巨噬细胞在ACPA刺激后Akt和NF-κB信号通路活化水平下降,而JNK信号通路活化水平未发生明显变化。上述结果表明,ACPA在体内和体外均可活化巨噬细胞NLRP3炎性小体诱导IL-1β炎性因子产生;CD147可能参与ACPA对巨噬细胞的活化过程。第二部分:ACPA增强CD147-integrinβ1相互作用,活化下游Akt/NF-κB信号通路。免疫荧光染色实验结果表明CD147和ACPA在细胞表面共定位。Co-IP实验和SPR实验结果提示CD147和ACPA可发生相互作用。应用Co-IP实验进一步研究证实ACPA可增强CD147-integrinβ1相互作用。应用GRGDS阻断CD147-integrinβ1相互作用导致ACPA引起的Akt信号通路活化及pro-IL-1β表达受抑制。应用LY294002抑制Akt信号通路也可得到类似结果,即NLRP3炎性小体表达减少,IL-1β产生减少。该现象表明,ACPA促进CD147-integrinβ1相互作用,并活化下游Akt信号通路,诱导NLRP3炎性小体相关成分表达。免疫荧光定量分析和Western blot实验进一步证实ACPA引起的CD147-integrinβ1相互作用激活Akt信号通路后,导致下游NF-κB信号通路活化,并导致转录因子p65进入细胞核,促进NLRP3分子和pro-IL-1β分子转录。上述结果表明,ACPA可作为诱导剂促进NLRP3炎性小体的表达,为后续激活过程做准备。第三部分:ACPA诱导巨噬细胞释放ATP促进NLRP3炎性小体激活。应用ACPA处理PBMC来源的巨噬细胞,并应用萤光素酶法对细胞培养液中ATP水平进行检测,结果表明ACPA处理使PBMC来源的巨噬细胞培养液中ATP含量升高。干涉CD147或干涉integrinβ1或使用GRGDS阻断二者相互作用均可显著抑制细胞培养液中ATP含量升高。使用丙磺舒抑制Pannexin通道,可明显抑制胞外ATP含量升高和IL-1β的产生。结果提示,胞外ATP含量升高可能是ACPA活化巨噬细胞Pannexin通道引起胞内ATP外流所致。应用oxATP阻断胞外ATP与细胞膜表面P2X7受体结合或应用格列本脲阻断P2X7受体后,胞外ATP仍维持较高水平但IL-1β的产生明显减少。该结果证明,胞外ATP活化NLRP3炎性小体需要P2X7受体参与。上述结果表明,ACPA可通过增强CD147-integrinβ1相互作用而激活Pannexin通道,促进ATP外排;ATP外排至细胞外后与细胞膜表面P2X7受体结合导致细胞内NLRP3炎性小体激活。综上所述,我们首次发现ACPA促进NLRP3炎性小体表达与活化,引起RA患者关节局部IL-1β增加。ACPA处理可增强巨噬细胞CD147-integrinβ1相互作用,激活下游Akt/NF-κB信号通路使NLRP3炎性小体成分表达增加。此外,ACPA激活巨噬细胞Pannexin通道,引起ATP外排。外排至细胞外的ATP与细胞膜表面P2X7受体结合,最终引起NLRP3炎性小体活化。本研究提出了RA中ACPA促进IL-1β产生的机制,明确ACPA在疾病发生中的新作用,提供了RA治疗潜在的新靶点。