[目的]下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamuscell carcinoma,HSCC)是来源于下咽部组织的恶性肿瘤,具有发病隐匿、转移早和易复发的特点。从分子水平找出下咽癌差异性表达的基因及其可能调控的分子机制对于下咽癌的早期诊断以及生存率的提高具有重要意义。既往研究表明,miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥重要的调控作用,circRNA具有海绵吸附miRNA的功能。本课题利用二代高通量测序技术检测HSCC组织及癌旁组织中circRNA表达谱,筛选出差异性表达的circRNAs,通过生物信息学分析其海绵吸附miR-548c-3p。细胞水平上分析下咽癌细胞中miR-548c-3p及其靶基因TP53BP2对细胞増殖、克隆形成、迁移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响。本研究为探讨circRNA在下咽癌中表达情况以及海绵吸附的miR-548c-3p对下咽癌细胞(FaDu)生物学功能的影响,这些发现对于进一步阐明下咽癌的发生发展机制具有重要作用,对下咽癌早期诊断的靶点及下咽癌肿瘤标志物的发现提供参考。[方法]1.本文研究对象是初次接受手术治疗的63例HSCC患者,在手术中收集HSCC组织标本及对应的癌旁非肿瘤组织样本。其中3例新鲜标本行全circRNA高通量检测,根据测序结果分析肿瘤组织及其对应的癌旁非肿瘤组织中circRNA的表达谱;2.用R语言的GGPROT2包绘制散点图,主成分分析(PCA)测量六个样本基因长度,百万分率读取映射读取(RPM)测量表达水平,统计发现样本中circRNAs显著性差异。3.使用差异性表达(显著升高或下降)的19条circRNAs对送检的3例肿瘤及癌旁非肿瘤正常组织行Realtime PCR检测,以验证circRNAs测序结果。4.分析circRNA在不同的DNA片段及染色体中的分布情况,明确circRNA成环的特点及在染色体中分布特点。5.进一步采用基因本体(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,KEGG)分析差异表达 circRNA 可能的生物学功能。6.根据circbase数据库将分离出的前20个上调和后20个下调circRNAs在数据库中进行编号编码;采用Targetscan运算法则在服务器CircInteractome中筛选差异性circRNAs靶向的miRNAs。KEGG及miRPath数据库分析前40个差异circRNAs 与 miRNAs 的关系。7.使用Cytoscape软件构建miRNA-ceRNA网络,阐释circRNAs在ErbB和Hippo信号通路中的作用。8.利用美国癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)的食道癌队列中miRNA和mRNA数据对miR-548c-3p表达与患者生存率的临床相关性分析,Kaplan-Meier生存率分析。9.qRT-PCR检测miR-548c-3p在60例HSCC患者癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,Kaplan-Meier法检测患者5年生存率。10.miR-548c-3p mimic 分别转染 FaDu、HSC2、HSC3 和 D562 细胞,qRT-PCR检测转染效率,CCK-8及克隆形成实验检测细胞增殖。11.miR-548c-3p mimic转染FaDu细胞,transwell检测细胞迁移及侵袭,Annexin V/FITC检测细胞凋亡情况。12.通过Targetscan软件分析预测miR-548c-3p的候选靶基因,构建TP53BP23’UTR荧光素酶载体以及结合位点突变载体,检测miR-548c-3p对TP53BP2表达的调控作用。miR-548c-3p mimic及TP53BP2 3’UTR wt载体共转染FaDu细胞后观察荧光素酶活性情况,进一步通过qRT-PCR检测发现,转染miR-548c-3p mimic后TP53BP2的mRNA表达情况。13.裸鼠成瘤实验检测miR-548c-3p对HSCC肿瘤生长的影响。将miR-548c-3p mimic转染至FaDu细胞,并将细胞通过皮下注射至小鼠右背部,每5天对小鼠肿瘤大小进行测量,取出瘤体后进行qRT-PCR检测。14.miR-548c-3p mimic 转染 FaDu 细胞与 miR-548c-3p mimic 及pcDNA-TP53BP2载体共转染FaDu细胞对细胞增殖及克隆形成的影响相比较。15.采用tanswell实验检测细胞迁移及侵袭情况,miR-548c-3p mimic转染FaDu细胞与miR-548c-3p mimic及pcDNA-TP53BP2载体共转染FaDu细胞对胞迁移及侵袭相比较。16.使用Annexin V/FITC实验方法检测细胞凋亡情况,miR-548c-3p mimic转染细胞与miR-548c-3p mimic及pcDNA-TP53BP2载体共转染FaDu细胞后细胞凋亡情况相比较。[结果]1.同癌旁非肿瘤组织的circRNAs相比,HSCC组织中71条circRNAs表达显著增高,102条表达显著降低。2.差异性表达的19条circRNAs在3组(HSCC及癌旁非肿瘤正常组织)中经qRT-PCR验证后其中12条与测序结果一致。3.前体RNA通过反向剪接的方式产生circRNA,其形式包括外显子来源的circRNA(exonic circRNA,ecircRNA)、内含子来源的 circRN A(circular intronicRNA,ciRNA)、外显子-内含子 circRNA(exonic-intronic circRNA,EIciRNA)三种类型。其中外显子来源占大多数,其次是内含子来源。4.在KEGG通路中下调的circRNAs表达量较高,在胞饮、泛素介导的蛋白水解、Janus激酶(JAK)/信号转导子和转录激活子(STAT)信号通路中发挥作用;而上调的circRNAs在KEGG通路中表达量较少。GO分析发现在主轴方向建立,对抗菌药物的反应、转录的调控、细胞分裂生理过程中富聚大量的circRNAs;而下调circRNA与自噬、线粒体组织肌动蛋白细胞骨架组织、膜分裂和细胞粘附有关。5.CircRNAs 通过 miRNA-ceRNA 网络调节 ERBB 和 HIPPO 通路。CircRNAs充当miRNA海绵吸附作用是circRNA其发挥作用的主要机制。对于前20个上调和后20个下调的circRNAs利用circRNA数据库对其编号;使用TargetScan数据库分析circRNAs可能吸附的miRNA。191个增高、182个降低circRNAs对应着相应的miRNAs。miRNAs调控的mRNAs显著富集在多个信号通路,如ERGB、HIPPO、RAS,TGF-β,磷脂酰肌醇丝氨酸/苏氨酸激酶Akt/3-kinase和Wnt信号通路均有miRNAs调控的mRNAs富集。6.我们发现在HIPPO、ERGB两条通路上circ-0008287与circ-0005027与miR-548c-3p之间有协同调节转录关系。CircRNAs下调可能导致miR-548c-3p被释放,高表达的miR-548c-3p可能通过下游靶基因促进下咽癌的进展。miR-548c-3p对ErbB和Hippo通路基因的负调控。7.对TCGA数据库分析发现与正常样品相比miR-548c-3p在肿瘤样品中有很高的表达,miR-548c-3p表达高的患者其存活率较低。8.miR-548c-3p在HSCC患者癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织,低表达miR-548c-3p的患者5年生存率较低。与正常的人口腔粘膜上皮细胞(HOMEC)比较 miR-548c-3p 在 HSCC 细胞系(FaDu、HSC2、HSC3、D562)中表达下调。9.miR-548c-3p mimic转染FaDu细胞后抑制了 FaDu细胞的增殖、克隆、迁移及侵袭,促进FaDu细胞的凋亡。10.TP53BP2为miR-548c-3p的候选靶基因,荧光素酶报告基因检测发现,miR-548c-3p mimic及TP53BP2 3’UTR wt载体共转染FaDu细胞后,显著抑制了荧光素酶活性,转染miR-548c-3p mimic及TP53BP2 3’UTR mut载体后,对荧光素酶活性无显著影响,转染miR-548c-3p mimic后显著抑制了 TP53BP2的mRNA表达。11.miR-548c-3pmimic组小鼠的肿瘤体积及重量明显小于对照组,取出瘤体后进行qRT-PCR检测miR-548c-3p mimic组TP53BP2表达显著低于对照组。12.miR-548c-3p mimic 及 pcDNA-TP53BP2 载体共转染 FaDu 细胞后,逆转了 miR-548c-3p mimic对FaDu细胞增殖、克隆、迁移、侵袭及细胞凋亡的影响。[结论]1.CircRNA在下咽癌组织和癌旁非肿瘤正常组织中差异性表达;CircRNA(hsa-circ-0008287 和 hsa-circ-0005027)/miRNA(miR-548c-3p)/mRNAs 轴可能在Hippo通路上对下咽癌的进展发挥重要作用。2.miR-548c-3p在下咽癌组织和细胞株中低表达,抑制FaDu细胞增殖、克隆、迁移及侵袭,促进细胞凋亡,其表达模式符合抑癌基因的表达模式。3.miR-548c-3p 靶向结合 TP53BP2,miR-548-3p/TP53BP2 分子轴对下咽癌细胞増殖、克隆形成、迂移、侵袭、周期和凋亡等生物学功能的影响。本研究对于寻找下咽癌特异性的肿瘤标记物提供新的思路,也将为诊断和治疗下咽癌奠定了良好的理论基础。