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糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的主要微血管并发症之一,已成为糖尿病患者致死的主要原因。肾脏间质的纤维化是糖尿病肾病的主要病变。肾间质纤维化(RIF)是临床多种慢性进行性肾脏疾病进展至终末期引起肾功能衰竭的共同病理改变,以肾小管基底膜成份、间质细胞外基质(ECM)发生定性和定量改变、肾小管萎缩和肌纤维母细胞的积聚为特征改变,其最主要病变是由肾小管上皮细胞转分化而来的肌成纤维细胞(MyoF)的出现。TGF-β1是最主要的促纤维化因子,是各种因子引起肾小管上皮细胞转分化(EMT)的中心环节,它可通过多种途径引起EMT,导致MyoF的产生和RIF,其中TGF-β1/Smads途径是目前公认的肾小管上皮细胞转分化过程中最重要的信号转导途径。中医中药在防治DN方面显示出了良好的效果,但具体作用机制尚不十分清楚,故深入探讨中医药治疗DN的作用机理对于指导临床有着重要意义。通过查阅文献和前期研究显示,黄芪注射液联合葛根素注射液治疗RIF疗效较好,但它们针对RIF的具体作用靶点不清楚。因此,我们想通过黄芪注射液联合葛根素注射液对KKAy糖尿病小鼠肾间质纤维化的治疗及对TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)EMT过程的影响,进一步探讨中药黄芪和葛根治疗肾间质纤维化的机理,为中医药防治肾间质纤维化提供实验依据。研究目的：通过对KKAy糖尿病小鼠RIF和人肾小管上皮细胞EMT过程中TGF-β1及其Smads信号通路变化规律的研究,进一步探讨中药(黄芪注射液联合葛根素注射液)通过阻断EMT的进程,达到治疗肾间质纤维化的机理,揭示黄芪和葛根配伍治疗糖尿病RIF的作用环节,为黄芪和葛根配伍治疗糖尿病RIF提供科学依据。研究方法：(一)整体实验(1)将SPF级2型糖尿病模型KKAy小鼠分为模型组和黄芪注射液联合葛根素注射液组(治疗组)。同龄C57BL/J小鼠作为正常组。治疗组小鼠14周龄开始以腹腔注射的方式给药,于24周龄处死小鼠,取肾脏观察肾组织病理形态学变化。(2)免疫组织化学法检测小鼠肾组织中E-cadherin. a-SMA、TGF-p,和TGFp-RI蛋白的表达。(3) Western blot检测小鼠肾脏组织Smad3. Smad7蛋白的表达。(4) RT-PCR方法,检测小鼠肾组织中TGFp-RI和Smad3 mRNA的表达。(二)离体实验(1)将体外传代培养人肾小管上皮细胞(HK-2),分为正常组、模型组、治疗组。模型组以含TGF-β1 (8ng/ml)的10%细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液),共培养48h；治疗组给予含TGF-β1(8ng/ml)和黄芪注射液加葛根素注射液的10%细胞培养液共培养48h,并在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。(2)免疫组织化学法检测HK-2细胞中E-cadherin、a-SMA的表达。(3)Real-time PCR法检测HK-2细胞中E-cadherin、a-SMA-TGF-β1, TGFβ-R I、Smad3和Smad7 mRNA的表达。(4) Western blot检测HK-2细胞中TGF-β1蛋白的表达。研究结果：(一)整体实验(1)KKAy模型组小鼠24周龄,肾脏病理改变可见肾小管间质纤维化,炎细胞浸润,肾小管上皮细胞胞浆出现空泡变性,肾小管扩张；a-SMA、TGF-p1、TGFβ-R I和Smad3蛋白表达增加,E-cadherin、Smad7蛋白表达减少；TGFP-R I和Smad3 mRNA表达增加。(2)黄芪注射液联合葛根素注射液治疗后,KKAy小鼠肾组织病理损伤减轻,肾组织中a-SMA、Smad3、TGF-β1和TGFP-R I蛋白的表达减少,E-cadherin和Smad7蛋白的表达增加。(3)黄芪注射液联合葛根素注射液治疗后,KKAy小鼠肾组织中TGFβ-R I和Smad3 mRNA的表达减少。(二)离体实验(1)HK-2细胞给予TGF-β1刺激48h后,细胞形态发生明显改变,由铺路石样变为成纤维细胞样；细胞内a-SMA在蛋白和mRNA水平上的表达明显增多,E-cadherinzai蛋白和mRNA水平上的表达减少,TGF-p1、TGFβ-R I和Smad3 mRNA表达升高,Smad7 mRNA表达降低。(2)黄芪注射液联合葛根素注射液治疗后,HK-2细胞中a-SMA和TGF-β1蛋白的表达减少E-cadherin蛋白的表达增加。(3)黄芪注射液联合葛根素注射液后,HK-2细胞中a-SMA、TGF-β1、TGFβ-R I和Smad3 mRNA的表达受到抑制,E-cadherin和Smad7 mRNA的表达增多。研究结论：(1)黄芪注射液联合葛根素注射液可明显减轻KKAy小鼠肾小管间质纤维化的程度,抑制并逆转TGF-β1刺激诱导的HK-2细胞中EMT的进程,恢复上皮细胞的表型。(2)黄芪注射液联合葛根素注射液抗肾间质纤维化可能的作用机理：通过抑制和阻断KKAy小鼠肾间质纤维化和HK-2细胞EMT过程中TGF-β1及其受体介导的Smads信号通路中基因和蛋白的表达,提高Smad7和E-cadherin的表达,阻断并逆转EMT的过程,减少肾间质中成纤维细胞和细胞外基质成分的表达,恢复肾小管上皮细胞的正常表型,延缓肾间质纤维化的发生和发展。