论文部分内容阅读
背景:躁狂症是一种典型的精神疾病,是双向情感障碍的发作形式之一,临床表现为心境高涨、思维奔逸、精神运动性兴奋、自我评价过高等。躁狂症发作时,患者情绪失控,高危行为增加,易诱发躯体疾病,严重破坏社会功能。躁狂症作为一种影响广泛的情绪疾病,其病理生理学机制尚不清楚。典型抗精神病药即多巴胺第二受体阻断剂,能有效控制精神疾病的症状,但副作用较多,例如焦虑、抑郁、恶性症状群等。非典型抗精神病药通过5-羟色胺受体、谷氨酸受体发挥作用,例如5-羟色胺2C受体(5-HT2C receptor,5-hydroxytryptamine 2C receptor)激动剂MK212,该工具药对精神疾病的阴性症状和阳性症状均有良好的作用,副作用相对较小。一般来说,心境稳定剂常用于急性躁狂症的治疗,例如锂盐、丙戊酸盐等。目前,非典型抗精神病药也广泛用于躁狂症的治疗。哇巴因（ouabain）是一种钠钾ATP酶特异性抑制剂,向大鼠的侧脑室注射哇巴因,可诱发大鼠极度活跃行为,作为稳定的躁狂症动物模型,用于考察5-HT2C受体激动剂MK212的抗躁狂作用。精神疾病与信号转导通路密切相关,糖原合成酶激酶3β（GSK3β,Glycogen synthetase kinase 3）作为中介物,涉及多条信号转导通路,也受蛋白复合物的调控,如PI3/AKT通路、WNT通路等,躁狂症患者多个脑区GSK3β功能异常,其活性变化可能与双向情感障碍发病机制有关。谷氨酸系统异常是躁狂症的发病机制之一,研究发现,MK212可以不通过内源性多巴胺,直接发挥抗精神病作用,并降低伏隔核脑区的谷氨酸浓度,推测谷氨酸系统可能是MK212发挥抗精神病作用的潜在机制。目前,暂无5-HT2C受体激动剂MK212用于躁狂症治疗的研究,也无法证明5-羟色胺2C受体就是非典型抗精神病药发挥抗躁狂作用的机制,以及是否通过调控GSK3β信号通路或谷氨酸系统发挥作用。研究假设:推测躁狂症模型大鼠腹腔注射MK212,其活动性明显抑制,即MK212能抑制急性躁狂症的典型症状,5-HT2C受体是非典型抗精神病药发挥抗躁狂作用的机制,其作用具有高度特异性。另外,MK212通过调控GSK3β相关信号通路发挥抗躁狂作用,在目标脑区,如内侧前额叶、纹状体和海马,如果对照组和各实验组的GSK3β蛋白总量和磷酸化水平发生相应变化,说明GSK3β相关信号通路是躁狂症的细胞生物学基础。最后,如果MK212能抑制大鼠脑内谷氨酸能神经元的兴奋性,说明MK212可能通过调控谷氨酸系统发挥抗躁狂作用。实验目的:阐明5-HT2C受体激动剂MK212的抗躁狂作用,以及MK212是否通过GSK3β相关信号通路或谷氨酸系统发挥效应。实验方法:实验一使用自发活动范式,向大鼠侧脑室注射哇巴因（1 mmol/L,5μl）,引发急性躁狂症状,表现为活动性显著升高。大鼠腹腔注射5-HT2C受体激动剂（MK212,0.1/0.5 mg/kg）,观察能否抑制高自发活动,再腹腔注射5-HT2C受体拮抗剂（SB242084,1.0 mg/kg）,如果5-HT2C受体在躁狂症发病机制中具有特异性,SB242084应该能逆转MK212对躁狂症症状的抑制作用。实验二采用蛋白质印迹法,实验一结束后,分离对照组与实验组动物的脑组织,包括内侧前额叶、纹状体和海马,提取蛋白质复合物,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,将目标蛋白与特异性抗体结合,考察GSK3β蛋白总量和磷酸化水平的变化,研究MK212是否通过GSK3β相关信号通路发挥抗躁狂作用。如果MK212通过GSK3β相关信号通路发挥抗躁狂作用,那么与对照组相比,实验组动物各个脑区的GSK3β蛋白总量以及磷酸化水平应该发生明显变化。反之,如果未发生明显变化,则MK212可能通过其他下游信号通路产生效应,GSK3β信号通路可能不是抗躁狂症药物发挥作用的细胞生物学基础。实验三通过膜片钳技术,在全细胞记录模式下,记录大鼠内侧前额叶第Ⅴ/Ⅵ层锥体神经元自发兴奋性突触后电流（sEPSCs,spontaneous excited postsynaptic currents）,循环灌流MK212（10/30/100μM）,观察自发兴奋性突触后电流频率和幅度的变化。如果自发兴奋性突触后电流的频率发生变化,说明MK212作用于突触前成分,可能调控谷氨酸释放,如果幅度发生变化,说明MK212介导突触后谷氨酸受体的功能。若二者均无变化,说明MK212未通过调控谷氨酸系统发挥作用。结果:实验一结果表明,腹腔注射0.5 mg/kg的MK212,15分钟之后,显著降低躁狂组动物的移动轨迹（p=0.000,n=8）和移动速度（p=0.000,n=8）。SB242084（1.0 mg/kg,i.p）能逆转MK212对移动轨迹（p=0.785,n=8）和移动速度（p=0.579,n=8）的抑制,使动物恢复极度活跃状态。该结果说明,MK212能抑制哇巴因诱发的极度活跃行为,SB242084能逆转MK212对极度活跃行为的抑制,即5-HT2C受体激动剂MK212具有抗躁狂效应,5-HT2C受体在躁狂症病理生理学机制中具有特异性。实验二结果表明,对照组与各实验组的内侧前额叶（p=0.184,n=8）、纹状体（p=0.249,n=8）和海马（p=0.474,n=8）的GSK3β蛋白总量无显著差异,该结果说明,各实验处理不影响GSK3β蛋白总量的表达水平。对照组与各实验组的内侧前额叶（p=0.063,n=8）、纹状体（p=0.415,n=8）和海马（p=0.227,n=8）的GSK3βser 9位点磷酸化水平无显著差异,该结果表明,GSK3βser 9位点可能不是MK212发挥抗躁狂作用的生理机制。实验三结果表明,与对照组相比,灌注MK212（100μM）显著降低内侧前额叶第Ⅴ/Ⅵ层锥体神经元自发兴奋性突触后电流的频率（p=0.046,n=8）,其他剂量MK212（10/30μM）对发放频率无显著作用。另外,MK212（10/30/100μM）对自发兴奋性突触后电流的幅度无明显影响。该结果表明,MK212（100μM）作用于突触前成分,能抑制突触前谷氨酸的释放,此外,MK212（100μM）不影响突触后谷氨酸受体的活性。MK212对谷氨酸系统的调控,可能是其发挥抗躁狂作用的潜在机制。结论:非典型抗精神病药5-HT2C受体激动剂MK212可独立发挥抗躁狂作用,不依赖其他心境稳定剂,能有效抑制躁狂症大鼠模型的高自发活动,体现了非典型抗精神病药治疗躁狂症的潜力,以及5-HT2C受体在躁狂症治疗中的高度特异性。MK212未通过GSK3β相关信号通路实现对躁狂症的调控,可能存在其他相关的信号转导通路。MK212调控谷氨酸系统,抑制内侧前额叶锥体神经元突触前谷氨酸的释放,可能与躁狂症的发病机制有关。