目的糖尿病现已成为危害人类健康的重要疾病之一,随着人们生活水平的提高和生活压力增大,以及遗传因素的影响,糖尿病的发病率正在日益增加。糖尿病发生发展的主要因素之一就是因为体内胰岛素分泌不足所导致的。针对此病虽然已有多种治疗的方法,但是这些传统的治疗方法不能从根本上治愈患者,导致患者终身依赖药物治疗,寻找全新的替代疗法已成为人们的主要攻克方向之一。胚胎干细胞分离自着床前的囊胚内细胞团细胞,在体外可以进行自我复制式的增殖(自我更新),同时还维持着变成神经、心肌以及肝脏细胞等不同胚层来源的各种细胞的能力(多能性),在临床的基础和转化应用方面有重要的价值。虽然前期已有很多研究将胚胎干细胞分化成胰岛素分泌细胞,但是这些细胞的功能以及分化效率都有待提高,且调控的机制报道的也不多。本研究在小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化过程中激活Wnt/β-catenin信号通路,检测激活此信号通路是否可以促进小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化。方法前期有研究报道:在小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中,通过三个阶段,分别添加三种不同的溶液,即溶液1、溶液2和溶液3(具体配方见实验方法部分),可以很好地得到具有功能的胰岛素分泌细胞。基于此研究方案,我们选择研究了Wnt/β-catenin信号通路在此过程中的功能,因为Wnt/β-catenin信号通路在胚胎向中内胚层的分化中具有重要的功能。当细胞外有Wnt蛋白时,体内β-catenin降解复合物GSK3、Axin和CK1等激酶不能形成,β-catenin在体内得以稳定积累,从而进入核内激活下游靶基因表达。因此本研究在小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的三个阶段中,通过在三个不同阶段的三个不同溶液中添加终浓度为3μM的GSK3蛋白的小分子抑制剂CHIR99021来激活Wnt/β-catenin信号通路,利用Western blot、q PCR以及免疫荧光等方法,检测胰岛素分泌细胞标志基因Pdx1、Ngn3、Pax4和Insulin1的表达情况;基于Tet-On表达调控系统,建立由小分子Doxcycline控制的β-catenin基因可诱导过表达胚胎干细胞系,在胰岛细胞形成的不同阶段进行诱导表达,观察其功能是否与CHIR99021类似;最后,利用慢病毒干扰系统,在胚胎干细胞中下调β-catenin的表达水平,观察其是否可以削弱CHIR99021在胰岛素分泌细胞形成过程中的功能。结果小鼠胚胎干细胞在三个不同时间段经过三种不同配方的溶液处理能够有效地分化成胰岛素分泌细胞。在胰岛素分泌细胞定向分化的早期和晚期阶段,添加CHIR99021和过表达β-catenin均可以提高胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞的分化效率,表现为Pdx1和Insulin 1的表达上调(P<0.01),而干扰β-catenin基因的表达则削弱了CHIR99021的功能(P<0.01)。结论在小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的特定阶段,激活Wnt/β-catenin信号通路能够促进胰岛素分泌细胞的形成,得到了功能更好的胰岛素分泌细胞。研究结果有利于优化人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的方案,将为获得更多有效降低血糖水平的胰岛细胞提供有用的线索,最终有助于未来找到糖尿病全新的治疗方法,从而造福患者。