目的:从一般状态、行为学、形态学、分子生物学等几个环节,通过观察大鼠的一般状态、体重等情况,旷场实验、转棒实验、水迷宫实验,海马神经元尼氏染色、β-半乳糖苷酶染色、Tunel染色,观察复合衰老模型大鼠整体和海马神经元老化、凋亡情况;通过透射电镜观察CA1区线粒体超微结构,海马组织ATP、ROS表达量,线粒体膜电位,观察复合衰老模型对线粒体结构和功能影响及穴位埋线对其干预作用;通过检测线粒体自噬的相关蛋白:LC3Ⅱ、P62,线粒体自噬Pink1/Parkin通路中Pink1、Parkin、Mfn2、Drp1,及线粒体生成相关蛋白PGC1-α,观察复合衰老模型对线粒体自噬的Pink1/Parkin通路,线粒体融合和分裂平衡,线粒体清除和生成平衡等方面的影响,探讨衰老过程中神经元线粒体功能、线粒体质量控制变化,及穴位埋线对线粒体相关变化的干预,试从线粒体质量控制,尤其是线粒体自噬的Pink1/Parkin通路角度阐释衰老中线粒体相关机制和针灸埋线延缓衰老的可能机制,为临床应用提供相应的依据。方法:按照体重排序,采用SPSS17.0统计软件将动物随机分为对照组、模型组、穴位埋线组、假埋线组、雷帕霉素组、3-MA组,每组15只。对照组大鼠给予10周腹腔注射生理盐水;模型组给予10周腹腔注射D-半乳糖（150mg/Kg/d）,同时从第一周始给予慢性不可预期性应激刺激,共应激10周;穴位埋线组在D-半乳糖注射+应激基础上,从第一周始,每周穴位埋线一次,共10次;假埋线组在D-半乳糖注射+应激基础上,每周假埋线一次,共10次;雷帕霉素组在D-半乳糖注射+应激基础上,在第9周始给予雷帕霉素（1.5nmol/5ul,5.49ug/kg）侧脑室注射,共注射14天;3-MA组在D-半乳糖注射+应激+穴位埋线基础上,在第9周始予以3-MA（400nmol/5ul）侧脑室注射,共注射14天。造模完成后,每组选取3-5只大鼠,在双侧海马予以LC3慢病毒注射,每侧3ul。埋线处方:选取“百会”“足三里（双）”“合谷（双）”“太冲（双）”作为穴位埋线处方。其中“百会”“足三里（双）”一组,“合谷（双）”“太冲（双）”一组,两组交替埋线。实验过程中,观察大鼠饮食、毛发、活动、精神状态等一般情况,给各组大鼠每周称量体重一次。10周造模结束后,进行旷场试验、转棒试验及Morris水迷宫等实验,行为学实验结束后立刻取材,β-半乳糖苷酶染色观察海马神经元老化情况;尼氏和tunel染色观察神经元形态及凋亡;透射电镜观察海马CA1区的超微结构如线粒体,自噬体形成情况;ATP、ROS、线粒体膜电位（mitoΔ ψ）检测观察线粒体功能变化;免疫荧光检测海马自噬形成情况;Western Blot检测自噬经典蛋白及Pink1/Parkin 通路 LC3Ⅱ、P62、Pink1、Parkin、Mfn2、Drp1,及线粒体生成蛋白PGC1-α 表达。结果:1.各组大鼠一般状态改变模型组中大鼠经造模后,出现形体消瘦,毛发凌乱,眼神晦暗,饮食减少,懒动喜卧,常伴呼吸音粗等痰鸣声,抓取早期呈激惹和二便失禁,后期反应迟钝;与模型组比较,经穴位埋线后大鼠老化现象见改善;与穴位埋线组比较,假埋线组中大鼠改善不明显,老化程度与模型组相近;与穴位埋线组比较,雷帕霉素组中大鼠老化改善与埋线组类似,3-MA组中大鼠老化未见改善。2.各组大鼠体重结果造模过程中,各组大鼠体重均有所增长,其中对照组中大鼠体重增长幅度最高;与对照组比较,模型组大鼠增长程度略低;对照组和穴位埋线组体重增长趋势相近;与穴位埋线组相比,假埋线组大鼠体重增长程度略低。3.各组大鼠旷场实验结果与对照组相比,模型组大鼠在活跃度、中央区时间、中央区路程方面均有降低;与模型组相比,穴位埋线组大鼠在活跃度、中央区时间、中央区路程、总路程均有增加,假埋线组没有这种作用;与穴位埋线组相比,雷帕霉素组表现相近,仅总路程减少;与穴位埋线组比较,3-MA组大鼠在中央区时间缩短。4.各组大鼠转棒实验结果与对照组相比,模型组大鼠转棒上停留时间缩短,掉落次数增加;与模型组相比,穴位埋线组停留时间增加,掉落次数有所减少,假埋线组则没有差异;与穴位埋线组相比,雷帕霉素组、3-MA在转棒停留时间减少,掉落次数增加。5.各组大鼠水迷宫实验结果随着训练时间延长,各组大鼠逃避潜伏期逐渐缩短,在定向航行实验后3天中,与对照组相比,模型组大鼠逃避潜伏期时间延长;与模型组相比,穴位埋线组逃避潜伏期时间缩短,假埋线组则没有差异;与穴位埋线组相比,雷帕霉素组潜伏期时间相近,3-MA组潜伏期延长。6.各组大鼠β-半乳糖苷酶染色结果对照组海马神经元排列整齐,未见明显老化细胞;模型组海马可见广泛散在分布的蓝染老化细胞;穴位埋线组海马区衰老细胞较少,几乎未见衰老细胞,假埋线组可见较多老化细胞,较模型组无差异;与穴位埋线组比较,雷帕霉素组细胞老化情况相近,3-MA组衰老细胞增加。7.各组大鼠尼氏染色结果对照组海马神经元排列整齐、细胞圆润淡染,轴丘尼氏体分布均匀;经过造模后,模型组在海马齿状核区（DG区）出现较多皱缩变形细胞;与模型组比较,穴位埋线组海马神经元排列整齐,形态尚可,仅见少量散在变性细胞;假埋线组海马DG区分布较多深染细胞,较模型组形态无变化;雷帕霉素组神经元整体上排列整齐,深染变形神经元减少;3-MA组与模型组相近,DG区可见较多变形深染神经元。8.各组大鼠Tune1染色结果对照组的海马区出现较多带绿色荧光的凋亡细胞,以齿状核DG区为著;模型组及穴位埋线组海马呈散在绿色荧光;假埋线组海马CA1区和DG区存在绿色阳性细胞;与假埋线组比较,雷帕霉素组和3-MA组大鼠海马阳性凋亡细胞减少。9.各组大鼠海马CA1区透射电镜结果对照组细胞内超微结构正常、核膜光滑、细胞器较多、形态正常,突触丰富,微管微丝结构稳定;模型组可见核膜固缩内折,细胞器变性、排列紊乱,线粒体变少、肿胀变形、嵴断裂消失,内质网肿胀脱颗粒,突触变少,骨架结构降解,可见较多脂褐素;穴位埋线组细胞核较圆润,线粒体略肿胀,尚有较多正常线粒体,可见各个阶段的溶酶体;假埋线组与模型组无差异;雷帕霉素组细胞结构尚可,细胞核圆润,核膜光滑完整,细胞质内质网、高尔基体分布丰富,线粒体数目尚可,略显水肿,线粒体嵴分布略稀疏,可见各级溶酶体,偶见脂褐素沉积;3-MA组与模型组形态相近。10.各组大鼠ATP染色结果对照组大鼠海马ATP表达丰富,阳性细胞均匀分布在海马各个区域;与对照组比较,模型组海马ATP表达减少,表达主要集中在神经元周围组织;与模型组比较,穴位埋线组海马ATP表达增加,表达区域以神经元密集区为主,假埋线组ATP表达与模型组无差异;与穴位埋线组比较,雷帕霉素组ATP表达未见差异,3-MA组ATP表达较穴位埋线组减少。11.各组大鼠ROS染色结果对照组大鼠海马ROS表达尚可,整体荧光暗淡,以齿状核区荧光量最为密集;与对照组比较,模型组ROS表达增加,荧光明显增强;与模型组比较,穴位埋线组海马ROS表达下降,荧光整体减弱;假埋线组海马ROS表达较模型组无明显变化;与穴位埋线组比较,雷帕霉素组ROS表达无差异,荧光均较微弱;3-MA组海马区荧光增强,ROS表达增加。12.各组大鼠线粒体膜电位结果对照组海马红/绿荧光比值最高,线粒体膜电位正常,细胞状态较好;与对照组相比,模型组线粒体膜电位下降,红/绿荧光比明显下降;与模型组比较,穴位埋线组和假埋线组线粒体膜电位有恢复,比值略有升高;雷帕霉素组与模型组相近,3-MA组线粒体膜电位最低。13.各组大鼠海马LC3免疫荧光染色结果对照组LC3双荧光均较明显,可见较多带有双荧光颗粒的细胞;与对照组比较,模型组荧光减少,绿色荧光较强,红荧光相对微弱,红/绿荧光比值下降;与模型组比较,穴位埋线组的绿色荧光减弱,红色荧光增多,红/绿荧光比值有所上升;与穴位埋线组相比,假埋线组大鼠海马荧光量总体减少,红色荧光相对更少;与模型组比较,雷帕霉素组红荧光相对增强,红/绿荧光比值逆转;3-MA组总荧光量减少,红/绿荧光比值略回升。14.各组大鼠蛋白 LC3、P62、Pink1、Parkin、Mfn2、Drp1,PGC1-α 表达结果与对照组比较,模型组海马线粒体自噬相关LC3、P62、Pink1、Mfn2蛋白量增加,线粒体生成蛋白PGC1-α减少;与模型组比较,穴位埋线组线粒体自噬蛋白表达相近无差异,线粒体生成蛋白PGC1-α表达增加;假埋线组中LC3、P62、Pink1、Mfn2、PGC1-α蛋白表达均有降低;雷帕霉素蛋白表达总体趋势与穴位埋线相同;3-MA蛋白表达趋势与模型组相近。结论:1.D-半乳糖结合慢性应激复合衰老模型大鼠在一般状态、自主活动、运动协调性、肌肉耐力、空间记忆、认知能力出现衰老退行性表征,海马的组织病理学、细胞超微结构均出现变性、老化、凋亡等表现,提示复合衰老模型大鼠的模型建立成功。2.D-半乳糖结合慢性应激复合衰老模型大鼠在线粒体结构和功能有损伤减退的表现,提示复合衰老模型的损伤机制与线粒体有关。3.穴位埋线对复合衰老模型大鼠的一般情况、行为学、海马病理组织学、神经元超微结构、线粒体功能均可改善,这种作用与自噬促进剂雷帕霉素相似,并且能被自噬抑制剂3-MA所消除,提示自噬至少部分参与到穴位埋线抗衰老机制中。4.运用LC3双荧光慢病毒标记海马区自噬活动,衰老组大鼠红/绿荧光较对照组降低,提示衰老可影响自噬小体与溶酶体融合过程,阻碍自噬流的流畅进程。穴位埋线组老化表现有所改善,说明穴位埋线可通过调节衰老对自噬的影响,减弱衰老对自噬下调程度,减轻衰老对自噬下游的阻碍作用以维持细胞内稳态。5.模型组对线粒体自噬相关蛋白表达增多,线粒体生成蛋白表达降低,结合衰老中自噬小体降解减少,提示衰老中可由线粒体清除受阻、生成不足等共同所致。总之穴位埋线通过调控自噬溶酶体的形成、降解,修复完整自噬流,促进细胞内受损线粒体清除,促进线粒体生成,以保护神经元,抗应激损伤,延缓衰老的进程。