一、背景与目的克罗恩病（Crohn’s disease,CD）是一种慢性复发性肠道炎症,病因尚不明确。目前认为遗传易感性、肠道菌群以及免疫系统异常与CD的发生机制相关。淋巴管异常是CD常见的病理表现,也是CD粘膜水肿及肠道炎症的重要机制。研究发现CD患者肠淋巴管密度增高,且存在淋巴管扩张现象,而淋巴管密度降低可能与CD患者术后复发相关。动物实验结果显示,通过抑制Il-10-/-自发肠炎小鼠模型VEGFR-3信号通路,破坏肠系膜淋巴系统,观察到了小鼠结肠炎显著加重的现象。而通过使用VEGF-C上调肠系膜淋巴管系统,可显著改善小鼠的肠道炎症。鉴于肠系膜淋巴系统病变参与并促进了了CD的发生发展,我们推测,若能对CD患者的肠系膜淋巴系统炎症进行早期的药物干预,能对疾病起到更好的控制作用。而要实现药物对于肠系膜淋巴系统的靶向,需要借助生物纳米材料对模式药物进行搭载和包装。近几年,因为糖尿病、人类免疫缺陷病毒感染等疾病日常管理的需要,一系列的肠淋巴靶向策略取得了一定程度上的突破。这些策略主要通过靶向特定细胞或特定受体,介导肠上皮细胞内吞,从而达到被肠系膜淋巴系统特异性吸收并释放药物的目的。但令人遗憾的是,这些策略真正被应用于临床还存在若干问题,其中最为主要的是,药物肠淋巴转运效率水平仍然较低。鉴于此,为了能有效地实现CD患者的肠系膜淋巴系统靶向,长链脂肪酸途径进入了我们的视野。不管是内源脂肪酸（以胆汁酸为主）还是外源脂肪酸,在被肠上皮细胞吸收后,都会经过内质网的再装配形成脂蛋白,从而进入肠淋巴管。过去的研究表明,和脂肪酸同时服用可提高模型药物在被禁食狗淋巴管吸收的效率,同时胆汁酸可以提高药物在禁食大鼠中的淋巴转运。已有研究证明,通过将甘氨胆酸与实性纳米颗粒偶联,可以通过肠上皮细胞上的钠依赖性胆汁酸转运体,实现模式药物对肠淋巴系统的高效率转运。由此,我们想到能否利用长链脂肪酸可以被肠淋巴系统特异性吸收的性质,构建一种载体,实现对于肠淋巴系统的靶向干预,改善CD患者淋巴系统功能,并进一步缓解肠炎的进展。本课题首次探究了肠系膜淋巴管靶向给药在克罗恩病治疗领域的可行性,以CD动物模型Il-10-/-小鼠为研究对象,通过构建肠淋巴系统靶向载体,采用组织病理学及分子生物学手段,着眼于肠淋巴系统药物靶向后的病理生理及功能变化,以肠淋巴—肠道溃疡相互作用为切入点,探索肠淋巴系统作为CD潜在治疗靶点的可能性,并为CD患者药物干预提供病理机制及治疗参考。二、材料与方法第一部分构建模拟乳糜微粒的纳米材料及表征、载体淋巴靶向的功能验证1.材料的构建。以介孔硅材料（MSN）为母核,在其表面通过共价联接的方式,修饰α-α’-二月桂精（α-α’-dilaurin）,将联接长链脂肪酸后的材料命名为LMSN,最后在95%乙醇相中在其表面包裹纳米肠溶衣（Eudragit co-polymer L100）,将最后得到的材料命名为ELMSN。2.材料的表征。主要包括材料形貌、释放曲线、胞吞胞吐等实验。通过透射电镜（TEM）研究材料在制备过程中不同阶段的形貌变化。通过氮气吸附试验（BET）测定MSN,LMSN,ELMSN的孔径分布和吸附脱附曲线（Nitrogen adsorption/desorption isotherms）。在模拟胃液和模拟肠液中,研究MSN,LMSN,ELMSN在模拟消化道环境中的药物释放。在Transwell膜上培养Caco-2细胞,并将FITC标记的纳米材料与之共孵育,研究材料在长链脂肪酸标记前后对肠上皮细胞的渗透率。使用Genistein等一系列胞吞胞吐抑制剂,研究MSN,LMSN的入胞出胞途径。3.淋巴靶向功能的验证。通过小动物成像仪（IVIS Spectrum System）观察FITC标记的MSN和ELMSN灌胃后在不同时间段在消化道内的分布情况,同时对不同时间段下的消化道各节段做荧光切片,进一步研究材料在全消化道（gastrointestinal tract,GI tract）中的分布情况。通过高效液相谱,研究大鼠在搭载模式药物（laquinimod,LAQ）的纳米载体灌胃处理后,其血液、肠道、肠系膜淋巴结中LAQ的药物浓度。第二部分肠系膜淋巴管靶向给药对于肠炎小鼠系膜侧炎症、肠淋巴管引流功能的影响及其具体的作用机制1.淋巴管及相关组织形态研究。通过BODITY灌胃,对肠系膜淋巴管进行成像,可在荧光体视镜下对有功能淋巴管进行计数。通过淋巴管内皮紧密连接蛋白（Claudin-1,Occludin,ZO-1）的免疫荧光,研究淋巴管内皮的完整性和连续性。通过对淋巴管周围脂肪组织（mesenteric adipose tissue,MAT）的H&E染色病理切片,研究淋巴管周围脂肪组织的形态及炎症状态。2.淋巴管功能研究。通过LYVE-1免疫组化对粘膜下毛细淋巴管进行计数,通过Western blot研究淋巴管相关生长因子通路VEGF-C/VEGFR3蛋白水平,进一步研究淋巴管增生（lymphagiogenesis）状态,通过Evans blue实验,研究淋巴管引流功能。3.肠系膜淋巴侧炎症水平研究。通过q RT-PCR测定肠系膜局部组织中炎症因子TNF-α,IL-1β,IFN-γ,IL-6 m RNA水平,以及周围脂肪组织炎症相关脂肪因子adiponectin,leptin和resistin m RNA水平。第三部分肠系膜淋巴管靶向给药对于Il-10-/-小鼠肠道炎症的影响1.肠系膜淋巴靶向给药对肠炎小鼠一般情况的影响。在为期4周的治疗周期中,每周测定各组小鼠体重变化,每天使用Hemoccult Sensa试剂盒测定小鼠便血情况,结合小鼠粪便形成度进行疾病活动度评分评估肠炎小鼠的一般状况。治疗周期结束后处死小鼠,取结肠组织行病理切片,根据其病理评分评估小鼠肠炎严重程度。2.肠炎小鼠给药后相关炎症因子及炎症通路蛋白表达量的变化。使用ELISA试剂盒测定给药0,2,4周后小鼠血浆中TNF-α和IL-6水平,通过q RT-PCR测定肠系膜局部组织中炎症因子TNF-α,IL-1β,IFN-γ,IL-6 m RNA水平,通过Western blot测定验证相关通路蛋白p65,IκB及其磷酸化蛋白的表达水平。3.肠系膜淋巴靶向给药对肠炎小鼠肠道菌群的影响。通过16SrRNA技术测定小鼠给药后粪便中菌群的丰度及分布情况,通过气-液联合液相色谱测定小鼠粪便中7种短链脂肪酸（short chain fatty acid,SCFA）的含量。三、结果第一部分构建模拟乳糜微粒的纳米材料及表征、载体淋巴靶向的功能验证1.透射电镜观测下,MSN和LMSN均显现出均一球形结构,在包被纳米肠溶衣后（ELMSN）,其表面介孔结构消失,氮气吸附试验（BET）显示,ELMSN表面介孔结构消失,提示纳米肠溶衣成功包被在材料表面。同时,在模拟胃酸和肠液的消化道环境下的药物释放实验显示,纳米肠溶衣能有效防止纳米载体搭载药物在上消化道的提前释放。2.不论是LMSN还是MSN都能有效穿过Caco-2细胞模拟的肠上皮细胞层,证实了该纳米载体可以有效地被肠上皮细胞所摄取,同时胞吞胞吐实验证实,纳米载体进入肠上皮细胞的主要途径是网格蛋白（clathrin）和小窝蛋白（caveolae）介导的细胞内吞。而纳米载体的出胞则和内体（endosomes）的成熟,以及高尔基体的囊泡分泌作用有关。3.小动物成像（IVIS）显示,长链脂肪酸修饰的纳米载体（ELMSN）相比于未修饰的载体（MSN）,在胃肠道中显示出更强的滞留能力,同时消化道各节段的荧光切片显示,纳米载体主要在十二指肠和回肠部位聚集,在荧光体视镜下,可以看到带有荧光的纳米载体（FITC@ELMSN）成功进入肠系膜淋巴管,并使其显影。4.HPLC显示经ELMSN载体给药,相较于普通口服给药,可以显著提高模式药物在血液及肠系膜淋巴结中的药物浓度。使用放线菌酮（CXI）阻断小鼠淋巴乳糜吸收后,可以显著降低载体给药组中小鼠血浆和肠系膜淋巴结中的药物浓度,而普通给药组几乎不受影响,进一步证明了,通过ELMSN载体给药可以使药物的转运和释放发生在肠系膜淋巴组织中。第二部分肠系膜淋巴管靶向给药对于肠炎小鼠系膜侧炎症、肠淋巴管引流功能的影响及其具体的作用机制1.肠系膜淋巴靶向给药可以抑制肠炎小鼠的淋巴管增生。免疫组化结果显示,在炎症状态下,Il-10-/-肠炎小鼠模型,与CD患者表现出了相似的肠系膜淋巴管增生状态,肠系膜侧的炎症因子TNF-α,IL-1β,IFN-γ,IL-6 m RNA以及NF-κB相关蛋白水平显著上调,LAQ@ELMSN处理可以有效降低肠系膜侧的炎症因子水平,同时下调下游VEGF-C/VEGFR3通路,从而抑制炎症状态下肠系膜淋巴管增生的发生。2.LAQ@ELMSN给药可以改善淋巴管功能。淋巴管特异性显像荧光剂（Bodipy FL-C16）显示,淋巴靶向给药系统可以显著增加肠炎小鼠肠系膜侧有功能淋巴管的数量,同时Evans blue实验显示肠炎小鼠淋巴引流状态也得到显著改善。其潜在的分子机制可能和NF-κB-i NOS信号通路被抑制有关。3.肠系膜淋巴管靶向给药可以修复淋巴管内皮结构,进而影响淋巴管周围组织。LAQ@ELMSN处理后肠炎小鼠的肠系膜淋巴管内皮紧密连接蛋白水平显著增高,淋巴液外漏得到改善后,可进而改善周围脂肪组织的肥厚增生、淋巴细胞浸润的状态,炎症相关的脂肪因子adiponectin,leptin和resistin m RNA水平也显著下降。第三部分肠系膜淋巴管靶向给药对于Il-10-/-小鼠肠道炎症的影响1.LAQ@ELMSN可深度缓解肠炎。肠炎小鼠体重、DAI变化,以及H&E病理切片显示LAQ@ELMSN给药相较于普通口服给药可更有效地改善肠炎小鼠的一般状况,显著降低局部组织中炎症因子TNF-α,IL-1β,IFN-γ,IL-6 m RNA水平,以及相关通路蛋白p65,IκB及其磷酸化蛋白的表达水平。2.肠淋巴靶向给药显示出在停药后,对肠炎持续的缓解作用。LAQ@ELMSN处理组停药后,2,4周后小鼠血浆中TNF-α和IL-6水平相较于基线水平（0周）未出现显著上升,提示淋巴引流的改善,可维持小鼠停药后肠炎的持续缓解。3.LAQ@ELMSN可改善肠道菌群分布及相关代谢产物。CHAO 1多样性分析显示肠淋巴靶向给药可增加肠炎小鼠粪便中的菌群丰度。减少了IBD相关致病菌的占比,增加了产SCFA相关菌群的占比。气-液联合色谱进一步显示LAQ@ELMSN给药可增加肠道中主要的七种SCFA的含量。四、结论与意义1.肠系膜淋巴管口服靶向材料ELMSN的构建,填补了国内外CD模型肠淋巴靶向的空白。此前已有大量研究证明CD患者存在肠淋巴系统病变,肠淋巴系统参与CD的发生发展,并很有可能是治疗CD的一个非常重要的潜在靶点,但此前由于缺乏有效靶向肠淋巴系统的手段,故对CD模型肠淋巴系统的直接药物干预在国内外还是空白。本研究通过构建可经口服后靶向肠淋巴系统的载体,可显著提高在肠淋巴组织处的药物浓度,观察药物对肠淋巴炎症的治疗效果,对控制系膜侧炎症具有重要的意义。2.肠淋巴系统靶向可成为CD患者治疗的新靶点。随着对于肠淋巴系统与CD患者肠道炎症之间密切联系的认识加深,进一步认识到肠系膜淋巴管增生,扩张,堵塞,导致淋巴回流障碍,是引起疾病早期的粘膜下水肿的重要原因,过去的研究主要认为CD的发生发展顺序,是从微生态失调——粘膜原发和继发免疫失调——透壁性炎症——异常肠系膜（outside-to-inside model）。而现在很多学者认为,淋巴功能障碍很可能是CD发病最开始的启动因素（inside-out model）。因此,肠淋巴功能异常与CD肠溃疡的产生和加重直接相关。改善肠淋巴功能对于CD肠道溃疡的缓解有促进作用,这一理论的研究和证明将对于CD的治疗方式和理念产生重大的突破和深远的影响。3.肠淋巴系统可调节肠道菌群。在生理状态下,肠道中细菌的部分碎片会经由肠系膜淋巴管向免疫细胞进行呈递,肠系膜淋巴管构成了免疫系统——肠道菌群之间的沟通渠道,并在维持肠道菌群稳态中起到不可或缺的作用。CD患者其肠道在病理状态下,由于肠系膜淋巴管功能受损,以及肠屏障功能的减弱,大量病原体及细菌过度增殖,引起肠道菌群紊乱。肠淋巴功能的改善对肠菌的丰度及其代谢产物产生积极影响,对于研究肠淋巴系统与肠道菌群的相互关系有着重要的意义。