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桑叶是国家卫生部公布的“食药两用”植物原料,含有丰富的营养和活性成分,具有较高的营养保健功效。桑叶多羟基生物碱(Mulberry leaf polyhydroxy alkaloids,MLPA)是其重要的活性成分之一,在体内外表现出较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性、改善胰岛素敏感性及上调葡萄糖转运体(Glucose transpoters,GLUT)4的表达等作用,是国内外学者广泛关注的一类血糖稳态调控因子。本课题从桑叶多羟基生物碱主要单体DNJ、Fagomine的提取工艺优化、动态变化规律、对α-葡萄糖苷酶的抑制活性、对3T3-L1细胞糖代谢的调节等方面对桑叶多羟基生物碱的糖稳态调节作用进行研究,旨在为桑叶降血糖功能食品研究提供理论依据。具体的研究结果如下:(1)桑叶多羟基生物碱提取工艺优化。本章内容以桑叶多羟基生物碱主要单体DNJ、Fagomine的提取得率为考察指标,选取影响其提取效果的原料质量浓度、提取时间、提取溶剂pH值等3个因素,根据单因素实验结果,利用Design Expert8.0.6软件根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,采用三因素三水平的响应面分析法对桑叶DNJ、Fagomine的提取工艺进行优化,得到的最佳提取工艺条件为:提取时间35.88 min,原料质量浓度0.06g/mL,pH5.19,DNJ的提取率0.32%,Fagomine的提取率0.22%,在此工艺条件下进行验证实验,得到DNJ的实际得率为0.315%,Fagomine的实际得率为0.21%。表明该模型有较好的拟合性,提高了有效成分的提取率。(2)品种、采收月份、成熟度对桑叶多羟基生物碱含量的影响。本章内容主要探明桑叶多羟基生物碱主要单体DNJ、Fagomine的含量随桑树品种、采收月份、成熟度等因素的变化规律。通过对源于9个桑树品种、6个采收月份、5个成熟度的桑叶样品中的多羟基生物碱单体成分DNJ、Fagomine含量进行分析,发现品种对DNJ、Fagomine含量影响较大,其中广东桑的“抗青10”DNJ平均含量水平较高,达到6.02mg/g,鸡桑“紫白4”的Fagomine平均含量水平较高,达到2.50mg/g,鲁桑“农桑12”DNJ平均含量较低,为0.87 mg/g,白桑“育2”Fagomine平均含量较低,为0.31 mg/g;通过分析6个采收月份间桑叶DNJ和Fagomine含量,发现DNJ含量呈现先升高后降低的变化规律,在8月份达到最高值,fagomine含量在8、9月份达到较高值,但其变化规律没有dnj的明显;以鲁桑“农桑12”为研究对象,考察5种成熟度桑叶样品的dnj和fagomine含量的变化规律,其中嫩叶中的含量最高,dnj和fagomine的含量分别为2.37mg/g和1.28mg/g,随着叶片的老化,含量逐渐降低,降至0.89mg/g和0.47mg/g,差异达166%和172%。综上所述,桑叶dnj、fagomine含量受桑树品种、采收季节及成熟度影响较大,在桑叶的利用上,应根据有效成分的变化规律,合理选择品种、安排采收时间及采收成熟度,以利于桑叶资源开发及临床应用。(3)分析桑叶多羟基生物碱提取物的化学组成及其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,结果表明,桑叶多羟基生物碱提取物抑制α-葡萄糖苷酶的ic50为1.59mg/ml,其中dnj含量为12.37μg/ml,多糖含量为0.69mg/ml,多酚含量为9.43μg/ml。分别测定dnj、多糖及多酚的α-葡萄糖苷酶抑制活性,确定dnj对α-葡萄糖苷酶的ic50为20.82μg/ml,多酚对α-葡萄糖苷酶的ic50为38.63μg/ml,多糖对α-葡萄糖苷酶的ic50为7.48mg/ml,由此推算出dnj、多酚、多糖对桑叶多羟基生物碱提取物抑制α-葡萄糖苷酶的贡献率分别为70%、48%和10%,三种活性成分对α-葡萄糖苷酶的抑制起到协同增效的效果,其中dnj在其中发挥着主要作用。(4)初步探明桑叶dnj基于ir-pi3k-akt-glut4及adipo-ampk-glut4两条信号途径的糖稳态调控机制。从pi3k、ir、glut4、ampk、adipo、akt等与糖稳态调控相关的因子变化来研究dnj对3t3-l1细胞糖稳态的调节,结果表明,从0.1μmol/l-10μmol/l的dnj处理组均能促进细胞葡萄糖的吸收,与对照组相比具有显著性差异(p<0.05),且呈现显著的量效关系;采用western-blot法对参与糖稳态调控相关因子的蛋白表达水平进行检测,结果表明,与对照组相比,0.1-10μmol/l的dnj能促进胰岛素受体(insulinreceptor,ir)、磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol3kinase,pi3k)、蛋白激酶b(proteinkinaseb,akt)蛋白的上调表达,除akt在0.1-1μmol/l时的表达增量不明显外,ir与pi3k表达量与dnj浓度呈显著的量效关系,0.1-10μmol/l的dnj能显著促进腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase,ampk)、脂联素(adiponectin,adipo)及葡萄糖转运体-4(glucosetransporter4,glut4)的表达,adipo与glut4表达量与DNJ浓度呈显著的量效关系;采用实时定量PCR检测与糖稳态相关的调控因子基因的表达,结果显示,与对照组相比,0.1-10μmol/L的DNJ能促进细胞IR表达的上调,且随着DNJ浓度的升高,表达量逐渐增大,0.5-10μmol/L的DNJ能显著促进GLUT4表达的上调,在0.5-5μmol/L浓度范围内呈现显著的量效关系,0.1-10μmol/L的DNJ能促进细胞AMPK和AKt基因的表达,在1μmol/L和5μmol/L时能够分别上调AMPK 3.6和3.4倍,在10μmol/L时可上调AKt表达2.5倍,且呈显著的量效关系,0.1-10μmol/L的DNJ能显著促进PI3K的上调,在10μmol/L时可达到2.7倍。推测DNJ可能通过IR-PI3K-AKt-GLUT4及ADIPO-AMPK-GLUT4两条通路对细胞的糖吸收起促进作用。