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胃癌，作为一种消化系统肿瘤，是全球五大常见癌症之一，发病率极高，严重威胁了公共健康。大部分的患者在中期、甚至晚期时才就诊，从而没有了手术治愈的希望。对于大部分中晚期的胃癌患者而言，主要的治疗方法是接受化疗，但疗效不容乐观。由于治疗效果并不理想，新的治疗策略需要探索。诱导分化疗法的原理是诱导低分化的癌细胞向健康细胞的方向演变分化，进而能够达到治疗肿瘤的目的，是未来治疗癌症的理想目标。当前临床上急性早幼粒细胞白血病的诱导分化剂有全反式维甲酸（ATRA），但其副作用和不良反应是临床需要解决的实际问题。本课题组对ATRA结构进行改造，从合成的衍生物中筛选出4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（ATPR），并且发现ATPR对多种实体瘤细胞具有周期阻滞和诱导分化的作用。我们选择胃癌细胞SGC-7901细胞株，经过研究得到ATPR通过下调14-3-3ε的表达发挥诱导G0/G1期阻滞作用。14-3-3ε作为一种分子伴侣蛋白广泛参与细胞周期调节过程，而ATPR通过下调14-3-3ε，进而影响哪些与之结合的细胞周期相关蛋白的功能并发挥周期阻滞的作用，是本研究的主要内容。 目的：通过免疫共沉淀结合质谱的方法，分离并鉴定14-3-3ε结合蛋白。生物信息学分析14-3-3ε结合蛋白，筛选出细胞周期相关蛋白，以阐明ATPR通过调控14-3-3ε的结合蛋白发挥诱导胃癌细胞SGC-7901周期阻滞的作用机制。 方法：溶剂组（0.1%乙醇）和ATPR组（终浓度1x10-5 mol/L）培养SGC-7901细胞48小时，离心收集细胞后提取细胞总蛋白、胞质蛋白和核蛋白。 （1）14-3-3ε结合蛋白的分离：14-3-3ε抗体免疫共沉淀处理后，将提取的复合物经SDS-PAGE胶分离，用考马斯亮蓝染色并观察。 （2）14-3-3ε结合蛋白的鉴定：将染色的蛋白质条带分组切下，胶内酶解成肽段，脱盐处理后以电喷雾离子源（ESI）的方式进入串联质谱分析，得到的原始质谱数据经过Proteome Discoverer工作站获得阴性组、溶剂组和ATPR组的14-3-3ε结合蛋白表达谱。 （3）14-3-3ε结合蛋白的生物信息学分析：将14-3-3ε结合蛋白提交到生物信息学网站（PANTHER）进行分析，利用其蛋白功能注释工具分析这些结合蛋白涉及的分子功能、亚细胞定位和生物学过程，筛选出其中与细胞周期相关的蛋白。 （4）14-3-3ε结合蛋白的验证：运用双向免疫共沉淀14-3-3ε和filamin A后WesternBlot进行分析；免疫荧光双染14-3-3ε和filamin A，在荧光显微镜下观察，验证14-3-3ε和filamin A的结合。 （5）非标记定量蛋白质组学方法分析filamin A在溶剂组和ATPR组的表达差异。质谱采集的数据导入非标记定量蛋白质组学软件（SIEVE），设定表达差异的倍数为1.5倍以上，p值＜0.05，序列覆盖率＞10%，肽段得分值＞16分和3个以上匹配的肽段。 （6）采用siRNA技术分别沉默filamin A和14-3-3ε后，流式细胞术分析filamin A和ATPR对细胞周期的影响。 （7）采用慢病毒方法过表达14-3-3ε后，SGC-7901细胞经1×10-5mol/L浓度的ATPR培养48小时，收集细胞后采用Western Blot检测filamin A和14-3-3ε在细胞中的总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白中表达水平。 （8）运用免疫组化方法检测20位胃癌患者的癌组织及配对癌旁组织中filamin A和14-3-3ε的表达情况，分析其在癌组织及配对癌旁组织的表达差异。 结果： （1）蛋白质组学的分析结果表明，去除阴性组鉴定的蛋白后，共有352个14-3-3ε结合蛋白同时在溶剂组和ATPR组被鉴定出。生物信息学分析筛选出35个结合蛋白参与细胞周期调节或分化过程，其中4个蛋白同时参与细胞周期调节和分化过程，包括filamin A、SFN、连环蛋白β-1和ANXA1。 （2）双向免疫共沉淀和免疫荧光双染实验证实了14-3-3ε和filamin A结合。与溶剂组相比，非标记定量蛋白质组学方法和免疫印迹方法均发现ATPR组filamin A表达明显下降，与14-3-3ε结合减少。 （3）ATPR处理或沉默filamin A后，细胞周期被阻滞在G0/G1期；沉默filamin A后，ATPR诱导G0/G1期阻滞的作用被削弱。 （4）ATPR通过14-3-3ε调控filamin A的亚细胞定位。ATPR处理后，filamin A由胞质向核内转移；过表达14-3-3ε可增加总的filamin A的表达，当采用ATPR处理后，filamin A的表达降低，由胞质向核内转移的趋势被改变。 （5）14-3-3ε和filamin A在胃癌组织中表达高于配对癌旁组织；与癌组织不同，癌旁组织中filamin A主要分布于核中。 结论： 本研究通过靶向蛋白质组学的方法筛选出ATPR处理前后SGC-7901胃癌细胞中与14-3-3ε结合的蛋白，并对其涉及的生物过程、类别和分子功能进行了生物信息学分析。Filamin A和14-3-3ε结合，经ATPR处理后二者结合减少。更进一步地我们发现14-3-3ε和filamin A参与ATPR诱导的G0/G1期阻滞过程并且ATPR通过调控14-3-3ε诱导filamin A核定位，这可能是ATPR发挥G0/G1期阻滞的作用机制。我们的研究结果表明，靶向14-3-3ε及其结合蛋白对于癌症是一个有价值的治疗策略。