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噪声性听力损失（NIHL）是因接触噪音而导致的进行性感音神经性听力损失。大约16%的成年人听力损失与工作场所的噪声暴露有关,职业噪声性听力损失是世界范围内最普遍的职业病,已成为一个全球性的公共卫生问题。并且由于治疗效果不佳,加强噪声性听力损失病因学和发病机制的研究,筛选可靠的预测噪声性听力损失发生发展的生物标志,已经成为我国职业病防治研究领域的重点。基于人群数据的流行病学研究和噪声聋动物模型的相关研究均表明,NIHL是以噪声作用为主,在遗传和环境因素双重影响下所导致。其中,进一步研究表明遗传变异对噪声性听力损失的贡献率大于50%。目前已经发现抗氧化系统基因、钾离子循环相关基因、热休克蛋白基因等的某些特定位点的变异可能与NIHL的易感性有关。导致NIHL的确切原因尚不清楚,但是越来越多的研究表明噪声暴露造成耳蜗的氧化应激损伤可能参与其中。小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier,SUMO）是一类新发现的泛素样分子。蛋白质SUMO化调节多种生理和病理过程,包括氧化还原平衡。NOX5的SUMO化抑制了其在ROS产生中的功能,而PRDX6的SUMO化促进其降解从而阻碍了ROS清除,另外,SUMO反应体系中某些关键的酶会被ROS活化,进而影响细胞凋亡过程中关键信号分子的表达,调控氧化应激诱导的细胞凋亡。考虑到导致NIHL的氧化应激机制以及SUMO化在细胞氧化应激中的调控作用,本研究将基于江苏省某大型化纤有限公司员工的职业健康体检信息、问卷资料、工作场所职业性噪声现场测量数据进行人群流行病学研究,结合生物信息学预测和细胞实验,探讨SUMO化影响NIHL发病风险的可能生物学机制,为SUMO化基因遗传变异应用于噪声性听力损失易感者的预测提供科学依据。一、基于人群数据的SUMO化基因遗传变异与职业性噪声听力损失发病风险研究通过UCSC数据库确定SAE1、UBA2、Ran NBP2、CBX4、UBE2I在基因组上的具体位置信息;采用千人基因组计划中中国人群的数据信息进行比对,找到以上位置中所有SNPs位点,再根据位点纳入标准确定最终的SNPs位点。纳入标准:最小等位基因频率（minor allele frequency,MAF）>0.05且哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE）的P值>0.05。基因连锁不平衡分析依赖Haploview 4.2软件进行,根据每个基因单倍域内SNPs之间的r~2值（r~2>0.8）与连锁系数（logarithm of odds,LOD）（LOD>3.0）来挑选SNPs。通过检索已发表文献,纳入多个SAE1、UBA2、Ran BP2、CBX4、UBE2I基因相关的功能性SNPs位点。根据筛选标准从江苏省内某大型化纤有限公司纳入符合要求的研究对象,并进行相应的问卷调查和健康检查以及生物样本的收集。委托上海翼和应用生物技术有限公司（http://www.biowing.com.cn/）采用多重PCR和二代测序技术完成候选位点的基因分型,χ~2检验分析各位点基因型分布情况,然后对基因型分布有差异的位点采用多因素logistic回归分析基因多态性与NIHL易感性的关系。1170个研究对象（病例=588,对照=522）被纳入到本研究中。根据筛选标准,SAE1、UBA2、RANBP2、CBX4、UBE2I基因的29个位点纳入研究。单因素分析结果表明只有CBX4的两个位点（rs1285249,rs1285250）的基因型分布在病例组和对照组间差别有统计学意义（P<0.05）。对于rs1285249,携带C等位基因者发生NIHL的风险低于携带G等位基因者（P<0.05）;对于rs1285250,携带C等位基因者出现NIHL的危险低于携带T等位基因者（P<0.05）,提示CBX4 rs1285249和rs1285250与NIHL易感性相关,并且分层分析和交互作用分析结果表明,在接噪工龄≤15年组和噪声暴露强度>85[d B（A）]组中这种关联更明显,除此之外,我们还发现单体型TGT（rs1285243-rs1285249-rs1285250）显著升高患NIHL的风险。上述结果为后续研究易感位点的遗传调控机制奠定了基础。二、CBX4影响NIHL发病风险的作用机制研究上述流行病学研究提示CBX4 rs1285249和rs1285250与NIHL易感性相关联,为进一步探索SNPs影响NIHL易感性的作用机制,我们通过生信分析和细胞实验来开展研究。1 SNPs的转录调控机制研究:通过分析ENCODE和Roadmap Epigenomics数据库的ChIP-seq数据,评价候选SNP能否影响转录因子与DNA的亲和力。结果表明,转录因子SP1对rs1285250位点DNA区域的结合评分最高。构建不同等位基因的报告载体和转录因子过表达质粒,通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。双荧光素酶报告基因实验结果显示rs1285250不同等位基因与转录因子SP1的结合活性有差异。在SP1过表达时,rs1285250 T等位基因的荧光素酶活性显著高于其他,提示rs1285250 T等位基因通过影响转录因子SP1与之结合,促进CBX4表达,升高患NIHL的风险。2 CBX4参与NIHL发生发展的分子机制研究:设计针对Sp1的siRNA,进行细胞转染,采用qRT-PCR和Western blot分别从mRNA水平和蛋白水平检测敲降效率,并检测Cbx4的表达情况;流式细胞仪检测si-sp1转染后细胞凋亡情况,WB检测凋亡相关蛋白的表达。结果发现,相比对照组,si-sp1组细胞中Sp1和Cbx4的mRNA水平分别下降了53.8%和61.0%,差异具有统计学意义,同样,CBX4蛋白水平也显著降低,提示SP1作为转录因子正性调控CBX4的表达。流式结果显示,转染si-sp1后,细胞凋亡率下降34%（P<0.01）,WB结果显示促凋亡蛋白Caspase3、cleaved-Caspase3、Bax表达水平均明显降低（P<0.001）,抗凋亡蛋白Bcl-2水平明显升高（P<0.001）,提示CBX4低表达可抑制耳蜗毛细胞凋亡。三、构建动物模型验证CBX4在NIHL中的作用为验证上述研究结果,我们构建了小鼠噪声暴露模型:以120d B白噪声暴露两天,2h/天,暴露结束后次日麻醉测ABR,摘眼球取血,处死并解剖小鼠耳蜗进行基底膜铺片,通过免疫荧光染色,于镜下观察耳蜗基底膜变化。提取小鼠耳蜗组织RNA后通过qRT-PCR检测相关基因表达情况;提取小鼠耳蜗组织蛋白,采用Elisa检测相关蛋白含量;提取血清,采用Elisa检测MDA、GSH-Px、T-SOD等氧化损伤指标。ABR结果表明噪声暴露组小鼠各频段听阈水平显著升高,免疫荧光结果显示相比于对照组,噪声暴露组小鼠的耳蜗基底膜顶段毛细胞排列紊乱,中段和底段均出现了不同程度的毛细胞缺失,其中基底膜中段毛细胞缺失最为严重（P<0.01）小鼠噪声暴露听损模型构建成功。Elisa结果表明噪声暴露组小鼠血清中MDA含量较高（P<0.01）,而GSH-Px水平显著低于对照组（P<0.01）,提示暴露组小鼠氧化损伤程度高于对照组,抗氧化能力相比于对照组降低;并且噪声暴露后,小鼠耳蜗组织中CBX4、SP1含量升高,促凋亡蛋白Caspase3、cleved-Caspase3、Bax含量均升高,差异均有统计学意义,而抗凋亡蛋白Bcl-2含量显著降低（P<0.001）,表明噪声暴露引起机体氧化应激损伤从而导致CBX4表达升高,促进毛细胞凋亡。细胞实验和动物模型与第一部分的人群流行病学研究互为验证,为CBX4作为NIHL的易感基因的生物标志提供重要参考,也为SUMO化修饰在NIHL中的作用机制提供了重要依据和线索,为其相关基因遗传变异应用于噪声性听力损失易感者的预测提供科学依据。总结本研究围绕SUMO化基因多态性与NIHL易感性的关系,从职业噪声暴露人群调查中发现联系,进而探索关联机制,最后动物模型的验证,我们得出如下初步结论:1.SUMO化基因CBX4多态性影响NIHL易感性,其中CBX4 rs1285249 G等位基因和rs1285250 T等位基因为NIHL的风险等位基因。接噪工龄和噪声暴露强度均会对易感性有影响,在进行易感人群筛选时要考虑到环境因素的交互作用,提供更有针对性的健康干预策略。2.CBX4 rs1285250所在基因区域具有一定的转录活性,通过影响转录因子SP1与DNA的结合发挥转录调控作用3.CBX4受转录因子SP1的正性调控,CBX4表达降低会导致促凋亡蛋白表达降低,抗凋亡蛋白表达升高,抑制毛细胞凋亡。4.动物模型证明噪声暴露导致CBX4表达升高,促进毛细胞凋亡。SUMO化基因CBX4是NIHL的危险基因。