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研究背景与目的我国近年的《心血管病报告》显示。心血管疾病占居民疾病死亡构成的40%以上,占总死亡原因的首位。心肌纤维化是多种心血管疾病进展中的一个重要病理改变,最终结果是导致心肌重构,心肌发生僵硬、心室舒张功能下降、冠状动脉的储量降低,甚至有可能直接导致猝死的发生。因此防治心肌纤维化具有重要意义。心肌纤维化是指心肌组织中胶原纤维过量沉积,胶原浓度和胶原容积分数显著增加,各型胶原比例失调及排列紊乱。心肌纤维化发生的细胞生物学基础b表现为心肌成纤维细胞的异常增殖以及细胞外胶原基质增加。有效抑制心肌成纤维细胞的增殖及胶原蛋白合成将可能延缓或阻滞心肌纤维化的发生发展。心肌纤维化受多种因素的调控,主要包括:肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)、内皮素(endothelin, ET)、缓激肽(bradykinin, BK)、儿茶酚胺(catecholamines, CA)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、基质金属蛋白酶(matrix metdloproteinases, MMPs)及细胞内钙等。作为细胞外间质的重要调节因子,TGF-β1具有刺激心肌成纤维细胞增殖、诱导其表型的转变、促进细胞外基质沉积、抑制胶原酶降解等效应,是目前最重要的促心肌纤维化的细胞因子之一。TGF-β1对心血管系统的影响主要表现在:(1)影响内皮细胞的功能:TGF-β1能诱导内皮细胞合成一氧化氮和内皮素-1,直接影响内皮细胞在体内外的屏障功能。(2)诱导细胞增殖及胶原分泌:TGF-β1能促进心肌成纤维细胞增殖,诱导心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,提高合成胶原的能力。(3)调节细胞外基质的降解:TGF-β1不仅能抑制基质金属蛋白酶的活性,还能诱导合成蛋白酶抑制物来减少细胞外基质降解,全面调节细胞外基质的沉积。(4)参与肾上腺索介导的心肌重塑。TGF-β1是许多致心肌纤维化因素最后必须触发的共同中介物之一,是公认的治疗纤维化靶点。在心肌纤维化过程中与TGF-β1相关的Smads蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein, Smads)主要为Smad2、Smad3及Smad7,其中Smad7通过抑制其他两类Smads来介导TGF-β1的效应,发挥负调控作用,各型Smads蛋白分子通过相互之间的精密协调作用共同完成生理及病理状态下TGF-β1的生物学效应。与TGF-β1相关的Erk蛋白则与心肌成纤维细胞的生长、增殖及分化关系最为密。磷酸化的Erk1/2可以促进磷酸化的Smad2/3在核内的聚集,进而与核内调控因子一起调节胶原基因的转录及表达,促进胶原基质的沉积。因此,对与TGF-β1相关的Smads蛋白及Erk蛋白的深入研究可为心肌纤维化的发病机制提供较多的理论依据,也能为心肌纤维化的防治提供更多有效途径。中医理论认为瘀血、痰浊与心肌纤维化密切相关。因此,在中药抗心肌纤维化方面,主要以益气活血和活血化痰为主。目前已有不少的中药复方和单体在治疗心肌纤维化方面取得了一定的进展。如中药单体:丹参酮ⅡA在动物体内及体外均具有显著的抗心肌纤维化作用,其作用机制可能与TGF-β1/Smads信号通路有关;川芎嗪抗心肌纤维化作用可能与内皮素和一氧化氮有关;单体药物苦参碱苦抗心肌纤维化的作用机制众多;中药复方研究比较多的为通心络、保心降压康、温胆汤等,复方制剂抗心肌纤维化的作用与降低自发性高血压大鼠心肌组织胶原含量有关。本课题组近年来一直从事中药复方抗高血压心肌纤维化作用机制的研究,前期研究结果显示血府逐瘀汤能够降低自发性高血压模型大鼠心肌组织中的羟脯氨酸含量,抑制心肌组织纤维化程度,降低高血压大鼠心肌组织中TGF-β1蛋白的表达。这提示,血府逐瘀汤抗心肌纤维化的作用,但是其作用机制还不明确。因此,我们将在细胞水平上探究血府逐瘀汤体外抗心肌纤维化的作用及其可能的作用机制。由于中药方剂含量无法做到精准定量是影响实验的重要因素。因此,在本实验中,我们首先通过建立血府逐瘀汤指纹图谱的方法,对该复方制剂进行质量监控,以确保在实验中使用药物质量的稳定可控性。研究内容与方法1.血府逐瘀汤指纹图谱研究:血府逐瘀汤配方颗粒用50%甲醇250m1常温溶解后,超声提取45 min,高速离心过滤,用高相液相色谱仪检测10批以上的样品色谱指纹图谱。导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统,选取具有代表性的共有峰作为Mark峰,建立血府逐瘀免煎复方颗粒指纹图谱共有模式,计算该10批样品图谱的相似度。2.体外心肌纤维化模型的建立:运用TGF-β1直接刺激心肌成纤维细胞,建立体外心肌纤维化模型,以Western Blot法检钡TGF-β1不同浓度及时间对心肌成纤维细胞诱导效果,选择最佳诱导浓度及时间。3.探讨血府逐瘀汤体外抗心肌纤维化的作用:实验细胞提前2h加入不同浓度血府逐瘀汤再联合使用一定浓度的TGF-β1,应用CCK-8法检测血府逐瘀汤对心肌成纤维细胞增殖的影响,应用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测血府逐瘀汤对细胞内细胞内Col Ⅰ, ColⅢ、α-SMA mRNA的表达影响;应用Western Blot法检测血府逐瘀汤对细胞内Col Ⅰ, ColⅢ、α-SMA蛋白表达的影响。4.探究血府逐瘀汤抗心肌纤维化的可能作用机制:实验细胞提前2h加入不同浓度血府逐瘀汤再联合使用一定浓度的TGF-p,,应用实时荧光定量实时荧光定量聚合酶链式反应检测血府逐瘀汤对细胞内关键蛋白Smad2、Smad3、 Smad7、Erkl/2 mRNA表达的影响。Western Blot法检测血府逐瘀汤对细胞内关键蛋白Smad2、P-Smad2、Smad3、P-Smad3、Smad7、Erk1/2、P-Erk1/2表达的影响。实验结果(1)血府逐瘀汤指纹图谱相似度结果显示:选取6个代表峰作为共有峰,该10批样品的程度相似度值均在0.901以上,RSD值为1.61%。(2)心肌纤维化模型结果显示:分别给予不同浓度.5、15、30 ng/mL TGF-β1诱导心肌成纤维细胞24h及48h后,与空白组比较,细胞内Col Ⅰ、ColⅢ、 α-SMA蛋白的表达上调(P<0.05),在5ng/mL TGF-β1诱导条件下,总胶原蛋白的相对表达量在24 h较为显著。(3)血府逐瘀汤抗心肌纤维化的作用:①CCK-8法检测结果显示:与空白对照组比较,TGF-β1组能够显著诱导细胞增殖,增殖率为126.28±0.92%(P<0.01),血府逐瘀汤(1:40、1:60、1:80)预处理细胞2h,再给予5 ng/mLTGF-β1共同处理细胞24 h,细胞增殖被抑制,增殖率分别为100.44±1.31%,109.03±5.34%,113.46±3.81%,与TGF-β1组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。②实时荧光定量PCR结果显示:与空白对照组比较,TGF-β1组Col Ⅰ、α-SMA mRNA的相对表达量显著增加(P<0.01),血府逐瘀汤不同浓度组(1:40、1:60、1:80)能够降低TGF-β1诱导的Col Ⅰ、α-SMA mRNA表达,各浓度组与TGF-β1组比较有统计学差异(P<0.01)。③Western Blot结果显示:与空白组相比,TGF-β1组细胞中Col Ⅰ、ColⅢ、α-SMA蛋白的表达量增加(P<0.05)。不同血府逐瘀汤均能下调TGF-β1所诱导的Col Ⅰ、ColⅢ、α-SMA蛋白表达,各浓度组与TGF-β1组比较有统计学差异(P<0.05)。(4)血府逐瘀汤抗心肌心肌纤维化的作用机制:①实时荧光定量PCR结果显示:与空白组比较,TGF-β1组Smad2 mRNA的表达上调(P<0.05),血府逐瘀汤能够下调Smad2 mRNA的表达(P<0.05),上调Smad7 mRNA表达(P<0.05)。②、Western Blot结果显示:与空白组相比,P-Smad2蛋白的表上调(P<0.01),P-Smad3蛋白的表达上调(P<0.01),Smad7蛋白表达下(P<0.05)。血府逐瘀汤下调P-Smad2、P-Smad3蛋白的表达(P<0.05),上调Smad7的表达。血府逐瘀汤各浓度组对P-Erk1/2、Erk1/2蛋白相对表达量无影响(P>0.05)。实验结论一、该10批血府逐瘀汤配方颗粒制剂色谱指纹图谱相似度在0.901以上,这表明我们实验用的药物质量稳定可控,可作为我们后期实验用药物。二、TGF-β1能够诱导心肌纤维细胞表型转化及促进细胞胶原蛋白的合成,这提示,我们体外成功构建心肌纤维化模型。三、血府逐瘀汤能够抑制TGF-β1诱导的心肌纤维细胞增殖,降低胶原蛋白的成及抑制细胞的表型转化,具有体外抗心肌纤维化作用。四、血府逐瘀汤抗心肌纤维化的作用可能与下调心肌成纤维细胞中P-Smad2、 Smad2、P-Smad3蛋白,上调Smad7蛋白的表达有关。