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花生及其制品是FAO/WHO认定的八大类食物过敏原之一,由于引起的过敏反应具有终身性,并且临床症状表现严重甚至危及生命,因此花生过敏备受人们的广泛关注。在日常生活中,花生通常被晒干后贮藏,再经热加工后被直接食用,或添加到食品工业的各类食品之中食用,因此研究热加工对嗮干花生中过敏原蛋白的结构、消化性及其致敏性的影响具有重要的实际意义。本论文以晒干后的花生仁为研究对象,采用常见的三种热加工方式(水煮、烘焙和油炸)对其进行处理,分析加工前后花生蛋白的结构及致敏性的变化。研究内容包括:采用三种方法提取花生蛋白,对比不同提取和加工条件下的蛋白提取率、组分和结构的差异;其次,通过体外模拟胃肠消化,比较加工对花生脱脂粉中蛋白消化性的影响;最后,评估花生蛋白提取物和脱脂粉消化产物的IgE结合能力以及体外诱导人嗜碱性粒细胞的脱颗粒能力。本研究的主要方法、结果及结论如下:1.首先对干燥后的花生仁进行热加工处理(水煮:100℃、15 min;烘焙:170℃、10 min;油炸:152℃,400 s),得到四组花生样品(包括未加工组),对花生进行研磨脱脂得到花生脱脂粉,采用凯氏定氮法测定四种花生样品中的总蛋白含量。利用三种提取方法对脱脂粉中的蛋白进行提取(方法1:利用50mmol/L的Tris-HCl在4℃下磁力搅拌提取;方法2:利用20 mmol/L的Tris-HCl在4℃下磁力搅拌提取;方法3:利用高序列两性离液剂在60℃下超声波处理提取),并采用Bradford法对提取液中的蛋白含量进行测定,计算蛋白提取率。采用SDS-PAGE实验对提取物中的蛋白组分进行鉴定。结果表明:利用三种方法提取加工花生中的粗蛋白时,方法3的蛋白提取率最高,它对最难提取的烘焙花生中蛋白的提取率可达25.85%,对其余三组花生的蛋白提取率高达50%以上。三种方法对烘焙花生中蛋白的提取率均显著低于其它三组样品,分别为3.72%、4.08%和25.85%。而SDS-PAGE的实验结果发现方法1提取的蛋白条带数目最为丰富,说明相比于其它两种提取方法,方法1可以从热加工花生中提取出更多种类的蛋白。2.利用圆二色光谱法和紫外光谱法研究了加工方法和提取方法对花生蛋白高级结构的影响,并将花生脱脂粉进行体外模拟消化,通过Tricine-SDS-PAGE实验鉴定消化产物的组分。结果表明:水煮花生蛋白提取物的三级结构变得更加紧凑,而二级结构变化不大;烘焙花生蛋白提取物的二级结构α-螺旋成分大量损失,并且紫外吸收强度降低,说明高温烘焙处理导致花生蛋白的高级结构遭到严重破坏;对于油炸花生,方法1和方法3得到的蛋白提取物的高级结构变得更加舒展,而方法2得到的蛋白提取物的高级结构则基本不变。因此,除了加工方法,不同的提取方法也可以影响花生蛋白的高级结构。胃肠消化结果显示,经过胃蛋白酶消化80 min后油炸花生所剩蛋白条带数目最少而且灰度最浅,说明油炸花生易被胃蛋白酶消化;而经过模拟肠液消化40 min后烘焙花生的蛋白灰度最浅,说明烘焙花生在肠消化时消化速率最高,热加工增强了花生蛋白的消化性。3.热加工导致花生中的蛋白结构和消化性发生变化,进而影响其致敏性。利用竞争抑制ELISA法测定了加工花生蛋白提取物和脱脂粉消化产物的IgE结合能力,结果表明:方法1得到的蛋白提取物中,油炸花生的IgE结合能力略强于未加工花生,水煮和烘焙花生的IgE结合能力则低于未加工花生,其IC50值分别为:油炸1.9μg/mL,未加工2.1μg/mL,水煮3μg/mL,烘焙4.5μg/mL;方法2得到的蛋白提取物中,油炸花生的IgE结合能力强于另外三组花生,其余三组的IgE结合能力相近,其具体IC50值如下:油炸3.5μg/mL,未加工7.0μg/mL,水煮6μg/mL,烘焙7.2μg/mL;方法3得到的四种蛋白提取物的IgE结合能力大小相近,其IC50值分别为:烘焙0.9μg/mL,油炸1.0μg/mL,水煮1.2μg/mL,未加工1.3μg/m L。四组花生脱脂粉的胃消化产物中,油炸花生与未加工花生的IgE结合能力相近,水煮和烘焙花生的IgE结合能力略有下降,但两者之间大小相近;四组脱脂粉的胃肠消化产物中,与未加工花生相比,油炸花生的IgE结合能力增强,水煮和烘焙花生的IgE结合能力减弱,该结果与方法1得到的蛋白提取物的结果相似,这可能与方法1能够提取出更多种类的过敏原蛋白有关。由此可见,对热加工花生样品的处理方法(包括提取方法和模拟消化处理)可直接影响其潜在致敏性的判定结果。以脱脂粉胃肠消化产物为对象进行判定,不受蛋白质提取损失的影响,其结果相对较为可靠。4.通过检测嗜碱性粒细胞脱颗粒模型中不同细胞因子的水平综合评估加工花生蛋白提取物和脱脂粉消化产物的致敏性变化。结果表明:利用不同因子评估热加工花生蛋白提取物的潜在致敏性时,发现不同因子的测定结果有所差异,如在检测方法2提取的水煮花生的蛋白提取物时,与未加工花生相比,水煮花生刺激人嗜碱性粒细胞脱颗粒程度降低;但刺激人嗜碱性粒细胞释放组胺的含量升高,说明其募集粒细胞促炎症因子的能力提高。而在评估热加工花生脱脂粉的模拟消化产物的致敏性时,结果较为一致。结果显示,与未加工花生相比,花生经油炸处理后可以降低刺激人嗜碱性粒细胞释放β-HEX的程度和钙离子内流的程度,即效应细胞脱颗粒程度降低;而经过烘焙处理后则可以提高刺激人嗜碱性粒细胞脱颗粒程度。由此可见,在对热加工花生的致敏性进行评估时,其结果还会受到评估方法的影响,而对脱脂粉进行模拟消化后,再采用嗜碱性粒细胞脱颗粒模型评估其致敏性时,结果相对较为可靠。