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目的以人动脉血管内皮细胞(HAEC)为培养模型,观察丹蒌片对细胞增殖、迁移的作用及其相关功能蛋白、信号通路蛋白的表达。探索丹蒌片促HAEC细胞增殖和迁移的可能机制。方法1.实验分组:本实验共分为五组,即血清饥饿组、空白对照组、丹蒌片组、可定组和混合组。每组由相应10%含药血清作用24小时后,进行后续实验。2.含药血清的制备:新西兰白兔16只,随机分为四组,每组4只。分别给予丹蒌片2.5g/kg/d、可定5mg/kg/d、丹蒌片2.5g/kg/d+可定5mg/kg/d灌胃,空白对照组以等体积生理盐水灌胃。连续灌胃5天后,腹主动脉采血,离心取上清,-70℃冰箱冻存备用。3.HAEC细胞增殖活力的测定:取指数生长期HAEC细胞,调整密度以2×103个/孔的密度接种于96孔板,完全贴壁后,无血清同步化24h。加不同10%含药血清作用24h,收集细胞培养上清于-70℃冰箱冻存备用。Cell Titer-Glo化学发光法测各组细胞增殖活力。4.HAEC细胞迁移能力的测定:取指数生长期HAEC细胞,调整细胞密度为1×105个/ml,取200μl单细胞悬液接种Transwell小室上层。各组小室下层加入600μl细胞培养上清液,温箱孵育24h后镜下观察各组迁移细胞数。5.检测各组细胞VEGF、SDF-1和e NOS含量:ELISA法测含药血清作用24h时后的细胞培养上清VEGF、SDF-1、e NOS的含量。6.检测各组HAEC细胞周期变化:各组含药血药作用24h后,收集细胞,用流式细胞术检测各组HAEC细胞周期各时相变化。7.检测各组HAEC细胞周期相关蛋白PCNA、Cyclin D1、CDK4的表达水平:采用Western blot法检测含药血清作用24h后,各组细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、PCNA的表达水平。8.检测各组HAEC细胞信号通路相关蛋白PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt的表达水平:采用Western blot法检测含药血清作用24h后,各组PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平。结果1.细胞增殖活力:结果显示与血清饥饿组和空白对照组相比,丹蒌片组、可定组和混合组细胞增殖活力显著增加(p<0.01);可定组增殖率高于丹蒌片组,但差异无统计学意义(43.49%±1.79%vs.42.88%±0.77%,p>0.05);而混合组显著性高于可定组、丹蒌片组(102.52%±5.73%vs.43.49%±1.79%,102.52%±5.73%vs.42.88%±0.77%,均p<0.01)。2.细胞迁移能力:transwell实验结果显示三个用药组促细胞迁移作用均显著高于血清饥饿组和空白对照组(p<0.01);200倍光镜下可见可定组细胞迁移的个数多于丹蒌片组(65.60±7.30vs.63.40±5.08个),但无统计学差异(p>0.05);而混合组促细胞迁移的能力均高于可定组、丹蒌片组(97.40±14.57vs.65.60±7.30个,97.40±14.57vs.63.40±5.08个,均p<0.05)。3.细胞周期分布:流式细胞术结果显示与血清饥饿组、空白对照组相比,三个用药组细胞增殖指数(pi)均明显增加(p<0.01);而混合组pi明显高于丹蒌片组和可定组(58.34%±2.05%vs.51.87%±2.21%,58.34%±2.05%vs.50.74%±1.89%,均p<0.01);但丹蒌片组与可定组比较差异无统计学意义(51.87%±2.21%vs.50.74%±1.89%,p>0.05)。4.各组细胞vegf、sdf-1、enos的表达:与血清饥饿组、空白对照组比较,三个用药组vegf、sdf-1和enos的分泌水平明显增加(p<0.01或p<0.05);且混合组显著高于丹蒌片组和可定组(p<0.01或p<0.05);而丹蒌片组与可定组比较差异无统计学意义(p>0.05)。5.各组细胞周期相关蛋白pcna、cyclind1和cdk4的表达:westernblot结果显示①pcna表达:与血清饥饿组、空白对照组比较,三个用药组pcna表达均明显上调(p<0.01);但三个用药组之间比较,差异无统计学意义(p>0.05)。②cyclind1表达:与血清饥饿组、空白对照组比较,三个用药组cyclind1表达量显著增加(p<0.01);且混合组显著高于丹蒌片组和可定组(p<0.01);而丹蒌片组较可定组差异无统计学意义(p>0.05)。③cdk4表达:各组cdk4蛋白表达量均无明显变化(p>0.05)。6.各组pi3k、akt、p-pi3k、p-akt蛋白表达:westernblot结果显示①pi3k和p-pi3k表达:各组pi3k蛋白表达量无明显变化(p>0.05);与血清饥饿组、空白对照组比较,三个用药组p-pi3k表达均明显上调(p<0.01);且混合组明显高于丹蒌片组和可定组(p<0.05);但丹蒌片组和可定组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。②akt和p-akt表达:与血清饥饿组比,其余各组akt蛋白表达量上调(p<0.01);但其余各组间比较,差异无统计学意义(p>0.05);而三个用药组p-Akt蛋白表达量与血清饥饿组、空白对照组相比明显上调(P<0.01);且混合组显著高于丹蒌片组、可定组(P<0.01);而可定组与丹蒌片组比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.丹蒌片具有促离体人动脉内皮细胞增殖、迁移、改善内皮细胞功能的作用,且与瑞舒伐他汀联合用药后作用进一步增强。2.丹蒌片及联合瑞舒伐他汀促离体人动脉内皮细胞增殖的作用可能通过上调PCNA、Cycin D1蛋白表达,促细胞周期由G0/G1期进入S期和G2/M期而实现。3.丹蒌片及联合瑞舒伐他汀促离体人动脉内皮细胞增殖、迁移的作用可能与其激活PI3K/Akt信号通路,上调p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平有关。