研究目的：甲状腺相关眼病的病理改变包括眼外肌纤维化、糖胺聚糖积聚、眶脂肪容积增多。本研究旨在检测培养的眼眶成纤维细胞是否存在不同的表型，表达CD90抗原有差异，并依据是否表达CD90分为两个亚群，分离这两个细胞亚群，分别进行肌成纤维和脂成纤维细胞诱导，研究他们在眼外肌纤维化、脂肪堆积和有害的炎症中所起的不同的作用，从而解释甲状腺相关眼病的一系列临床病理改变，证实成纤维细胞是甲状腺相关眼病的关键效应细胞，有着高度严格的分工，并为进一步阐明甲状腺相关眼病的发病机理提供新思路，为将来研制能阻断脂肪积聚或眼外肌纤维化的药物或蛋白用以有针对性地治疗该病提供理论依据。 方法：1.培养TAO病人和正常对照眼眶成纤维细胞，流式细胞术检测CD90的表达。 2.免疫磁分离法分离CD90+和CD90-的眼眶成纤维细胞，免疫细胞化学法和流式细胞术鉴定。 3.TGF-β1诱导CD90+和CD90-成纤维细胞亚群转化为肌成纤维细胞(MFB)，免疫细胞化学法检测代表MFB标志的平滑肌动蛋白α-SMA的表达情况。 4.分别诱导CD90+和CD90-成纤维细胞亚群转化为脂成纤维细胞，比较转化率。 5.RT-PCR法检测MFB诱导过程中CD90+和CD90-成纤维细胞亚群表达代表MFB标志的α-SMAmRNA、TGF-β1的下游基因结缔组织生长因子CTGFmRNA的情况，分析时间和剂量效应关系。 6.RT-PCR法检测MFB诱导过程中CD90+和CD90-成纤维细胞亚群表达与糖胺聚糖合成相关的透明质酸合成酶基因HASl、HAS2、HAS3，与炎症相关的环氧化酶COX2基因表达的影响，更进一步了解CD90+和CD90-眼眶成纤维细胞在TAO眼外肌纤维化、ECM聚积和炎症过程中的作用。 结果：1.正常人、TAO患者的眼外肌、眼眶脂肪/结缔组织来源的成纤维细胞均有部分细胞表达CD90。眼外肌来源的成纤维细胞中CD90+的细胞比例高于眼眶脂肪/结缔组织来源的成纤维细胞。 2.成功地将眼眶成纤维细胞分离成两个亚群。CD90+细胞群纯度大于98％；CD90-细胞群纯度大于95％。分离后的细胞经传代表型不变化。 3.在TGF-β1的作用下，CD90+眼眶成纤维细胞于48小时后部分细胞开始出现α-SMA弱表达，4天时大部分细胞呈阳性。CD90-眼眶成纤维细胞不表达α-SMA。 4.眼外肌来源CD90+成纤维细胞基本不能转化为脂成纤维细胞。眼外肌来源的CD90-成纤维细胞、眼眶脂肪/结缔组织来源的CD90+成纤维细胞、眼眶脂肪/结缔组织来源的CD90-脂成纤维细胞转化率分别为：10％、40％、72％。 5.TAO眼眶成纤维细胞在静息状态有一定的CTGF、α-SMA、HAS1、HAS3mRNA表达。部分病人的细胞表达HAS2mRNA，基本不表达COX2mRNA。 6.TGF-β1上调CTGFmRNA表达，3小时起效，12小时达峰值，此时CD90+细胞CTGFmRNA表达约为对照的13倍，CD90-成纤维细胞CTGF增加幅度较小，于3小时时增加至空白组的3倍后不再上升。lng/ml及以上的浓度TGF-β1均能有效地刺激CD90+细胞CTGF的表达增加，lng/ml的浓度的TGF-β1作用小于其他较高的浓度，5ng/ml及以上的浓度作用相当，组间两两分析无差异。lng/mlTGF-βl不能显著提高CD90-眼眶成纤维细胞细胞CTGF的表达，5ng/ml及以上的浓度作用相当，组间两两分析无差异。 7.TGF-β1上调α-SMAmRNA表达，CD90+细胞于24小时达峰值，并持续较长时间，约为静息状态的35倍；CD90-细胞α-SMA基因增加幅度明显比CD90+细胞低，于作用3小时后，涨至静息状态的4倍时就不再增加，维持至12小时，然后缓慢下降。lng/ml及以上的浓度TGF-β1均能有效地刺激CD90+细胞和CD90-细胞α-SMAmRNA的表达增加(P＜0.01)，各种浓度的TGF-β1作用相当，组间两两分析无显著差异。 8.TGF-β1处理CD90+和CD90-眼眶成纤维细胞均于3小时开始HAS1表达明显增加，6-12小时达峰值。TGF-β1所导致的CD90+细胞HAS1表达增加最高可达基础水平的30倍左右，明显高于CD90-细胞的8倍。大多数TAO患者的眼眶成纤维细胞经TGF-β1处理后，仍未能检测出HAS2表达。TGF-β1下调HAS3表达下降，12小时时作用最强，CD90+细胞下降到空白组的20％左右，并保持至整个实验观察期(48小时)。CD90-细胞下降到空白组的39％左右，维持至24小时。不同浓度的TGF-β1对CD90+和CD90-眼眶成纤维细胞表达HAS1、HAS2、HAS3的影响没有明显差异。 9.经TGF-β1处理后，CD90+和CD90-眼眶成纤维细胞均未检测出COX2基因表达。 结论：眼眶成纤维细胞表达CD90抗原不一致，存在至少两个细胞亚群，眼外肌来源的成纤维细胞以CD90+细胞为主，眶脂肪/结缔组织来源的成纤维细胞中含有较多的CD90-细胞。免疫磁珠分离法可有效地分离CD90+与CD90-细胞群。分离后的眼眶成纤维细胞表达CD90稳定，与培养、传代无关。CD90+与CD90-细胞群具有不同的功能，CD90+细胞群具有转化为MFB的潜能，与眼外肌纤维化、糖胺聚糖积聚有关；CD90-细胞群包括了具有脂肪细胞转化潜能的细胞群。TGF-β1上调CD90+成纤维细胞CTGF、α-SMAmRNA表达，TGF-β1通过CTGF介导CD90+成纤维细胞转化为MFB，并以独特的方式参与细胞外基质的代谢：上调HAS1，下调HAS3。TGF-β1和MFB并不通过影响PGE2的合成来参与眼眶的炎症反应。