新型冠状病毒肺炎（COVID-19）,简称新冠肺炎,是由新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的急性呼吸道传染病,临床表现从无症状感染、轻度流感样症状、肺炎到严重急性呼吸窘迫综合征,甚至死亡。大多数患者以发热、干咳和乏力为主要表现。轻症患者的表现是低热、乏力,重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和/或低氧血症,危重者则快速进为急性呼吸窘迫综合征、脓毒血症、难以纠正的代谢酸中毒和出血性功能障碍及多器官功能衰竭等。2019年底新冠肺炎疫情迅速蔓延全球,2020年3月11日,世界卫生组织认为当前新冠疫情可被称为全球大流行。至2022年5月,新冠肺炎已有5.3亿确诊病例,死亡病例近628万,给人类健康、医疗卫生系统、社会稳定和全球经济带来巨大压力。宿主的免疫系统在防御新冠病毒感染中发挥着关键作用,天然免疫系统迅速识别感染并触发适应性免疫,体液免疫消灭循环系统中的病毒,细胞免疫杀伤细胞内的病毒,二者共同防御病毒感染和保护机体免受损伤。然而,在SARS-CoV-2感染后,机体的体液免疫和细胞免疫是否都参与免疫应答?二者的免疫反应是如何相互作用的?机体康复后,免疫反应是否依旧存在,又可以持续多久,能否有效保护机体免受再次感染?显然,新冠肺炎患者的免疫应答特点及其免疫功能都充斥着未解之谜。因此,迫切需要了解新冠肺炎患者的免疫保护机制,为新冠肺炎的防控和候选疫苗的研发及评价奠定基础。针对上述问题,我们分别对新冠肺炎急性期重症患者、康复期轻症患者和康复后轻症和重症随访患者的体液免疫和细胞免疫应答的动态特征进行系统评价。首先,采用ELISA方法测定患者血清中Ig M和Ig G抗体反应及对Ig G抗体进行亚型分析,通过基于假病毒和真病毒的血清中和实验检测患者血清的中和抗体水平,并采用SARS-CoV-2全蛋白质组多肽芯片对患者血清识别的抗体表位进行筛选和比较。然后,利用流式细胞术对患者PBMCs进行不同免疫细胞的分类、巨噬细胞分型、记忆细胞分型和病毒特异性细胞因子表达的分析和比较,并采用ELISpot评价病毒特异性免疫反应。本研究主要包括三个部分:第一部分急性期新冠肺炎重症患者体液和细胞免疫应答特征研究首先,为了确认急性期重症患者是否产生体液免疫应答,我们检测了患者血清的SARS-CoV-2 S-RBD和NP特异性Ig M、Ig G抗体反应。结果表明,70%（7/10）患者均产生了S-RBD和NP特异性Ig M抗体及S-RBD和NP特异性Ig G抗体,且NP特异性Ig G抗体水平比S-RBD更显著。为了进一步确定Ig G抗体反应的亚型,我们对Ig G抗体进行Ig G1和Ig G3两个亚型分析。结果显示,患者血清中NP和S-RBD特异性Ig G抗体主要是Ig G1亚型。随后,为了评价患者的中和抗体反应,我们测定了血清样本的NAT50。结果显示,70%（7/10）患者血清的中和抗体为阳性,且不同个体间NAT50差异很大。然后,为了确认急性期重症患者是否产生SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应,我们对患者PBMCs进行不同免疫细胞的分类并评估T细胞的功能。PBMCs免疫细胞分类的结果显示,患者CD4+T细胞的百分比显著升高,而CD8+T细胞的百分比降低非常显著,导致重症患者CD4:CD8的比值显著升高。患者NKT细胞的百分比无明显变化,NK细胞的百分比显著降低。尽管患者PBMCs中T细胞（CD3+CD56-）的百分比呈上升趋势,但是绝对数量显著低于健康对照组。此外,患者CD4+T细胞IFNγ的表达水平显著降低,IL-17A和TNFα的表达水平无明显变化,而CD3-T细胞IFNγ和TNFα的表达水平显著降低。最后,对患者PBMCs进行IFNγELISpot分析,结果发现,所有重症患者中均未检测到SARS-CoV-2特异性T细胞。第二部分康复早期新冠肺炎轻症患者体液和细胞免疫应答特征研究首先,为了确认康复早期轻症患者是否存在体液免疫应答,我们检测了患者血清的SARS-CoV-2 S-RBD和NP特异性Ig M、Ig G抗体反应。结果表明,100%（14/14）患者均产生了S-RBD和NP特异性Ig M抗体及S-RBD和NP特异性Ig G抗体,且出院2周后的随访患者血清中Ig G抗体水平比Ig M抗体更高。接着,为了确定Ig G抗体反应的亚型,我们对Ig G抗体进行Ig G1、Ig G2和Ig G3三个亚型分析,结果显示,患者血清中NP和S-RBD特异性Ig G抗体主要是Ig G1亚型,所有患者中均未检测到NP或S-RBD特异性Ig G2抗体。随后,为了评价患者的中和抗体反应,我们测定了血清样本的NAT50,结果显示,100%（8/8）刚出院患者血清的中和抗体均为阳性,83%（5/6）出院2周的随访患者血清中和抗体为阳性,且不同个体间NAT50差异很大。然后,为了确认康复早期轻症患者是否存在SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应,我们对患者PBMCs进行不同免疫细胞的分类并评估T细胞的功能。结果显示,患者PBMCs中不同免疫细胞的分类无明显变化。然后,将患者PBMCs针对不同抗原进行IFNγELISpot分析,结果发现,S-RBD特异性T细胞分布最广,N蛋白特异性T细胞量最高,且N蛋白特异性T细胞数量与中和抗体水平呈正相关。第三部分康复期新冠肺炎患者体液和细胞免疫应答的动态特征研究首先,为了评价康复患者体液免疫反应随着时间的动态应答,我们检测了患者血清的SARS-CoV-2 S-RBD特异性Ig M、Ig G和中和抗体反应。结果发现,Ig M抗体的阳性率自症状出现后5～7周的100%逐渐下降至34～42周的50%,而Ig G和中和抗体的阳性率自症状出现后5～7周至34～42周一直都是100%,且直至34～42周,仍维持较高的抗体水平。无论轻症患者还是重症患者,Ig G抗体滴度并未随着时间显著下降。此外,Ig G和中和抗体的相关性自症状出现后5～7周至11～13周逐渐增强,然后维持至34～42周。接着,为了评价不同症状患者间免疫应答的差异,我们比较了轻症患者和重症患者的抗体水平。结果显示,重症患者Ig G抗体自症状出现后5～7周至11～13周明显高于轻症患者,到14～16周和34～42周显著高于轻症患者。此外,为了筛选康复患者血清的抗体表位及比较轻症和重症患者间抗体表位的表达差异,我们采用SARS-CoV-2全蛋白质组多肽芯片筛选血清的抗体表位。结果显示,鉴定出184个Ig G抗体表位,主要分布在S蛋白和ORF1ab。其中结构蛋白上S-82、N-21、N-17和N-40抗体表位存在于绝大部分患者血清中。轻症患者和重症患者血清中差异抗体表位的比较显示,与轻症患者相比,重症患者血清中有35个抗体表位的表达发生显著变化。在表达上调的抗体表位中,肽S-58和N-39表达上调得最为显著,其次是肽ORF3a-22、S-56、ORF1ab-389、N-17、S-126、N-3、N-13、ORF1ab-511、S-3、N-24、ORF1ab-398和ORF1ab-473等。表达上调的抗体表位明显比表达下调的更为显著。然后,为了评价康复患者细胞免疫反应随着时间的动态应答,我们检测了患者PBMCs中不同免疫细胞类型及SARS-CoV-2 S/N蛋白特异性细胞免疫反应。结果显示,症状出现后8～10周,康复患者SARS-CoV-2 S/N特异性T细胞的激活比例显著高于健康对照,且S/N特异性CD8+T细胞的激活比例显著高于CD4+T细胞。值得注意的是,SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应强烈偏向Th1细胞因子的表达,包括细胞因子IFNγ、IL2和IL4,且重症患者IFNγ和IL2水平高于轻症患者。此外,康复患者中分泌IFNγ的S特异性T细胞数量稍高于S特异性T细胞数量。总体来说,康复患者体内SARS-CoV-2 S/N特异性T细胞反应强烈,且病毒特异性免疫持续到至少症状出现后14～16周。综上,本研究通过对不同时期的新冠肺炎症状患者体液免疫和细胞免疫的系统评价,发现了体液免疫和细胞免疫在疾病发生发展进程中的动态变化特征,大多数患者在急性期可产生体液免疫,高效、高亲和力的抗体可维持至少10个月;细胞免疫在重症患者急性期受损,而在轻症患者康复期可检测到,患者细胞免疫维持至少4个月,且具有明显的Th1偏向性。此外,患者体液免疫和细胞免疫应答具有显著的异质性,且重症患者的免疫反应显著强于轻症患者。我们的研究支持SARS-CoV-2的保护性免疫,加深了对新冠肺炎致病机制的理解,并为未来研发优化新型冠状病毒抗病毒药物和疫苗提供新见解和新思路。