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禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由反转录科禽类C型反转录病毒禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的禽类重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。临床中REV感染引起的免疫抑制给养禽业带来重大的损失。近年来,REV的感染流行大多呈现与马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)和J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)等免疫抑制性病毒混合感染,这使得疫病的诊断和防控难度加大。因此该疾病的防控对养禽业的健康发展和生物制品质量的提高具有重要影响。目前,关于REV感染宿主引起的宿主免疫反应机制,以及病毒的致病机理尚不清楚。本研究以REV HA1101病毒株感染鸡外周血淋巴细胞和人工接种SPF鸡为研究对象,通过荧光定量PCR、转录组学和生物信息学等研究方法,初步探讨了病毒感染过程中可能发挥作用的细胞因子及相关信号通路,为进一步了解REV感染宿主后引起的免疫抑制和致病机理提供重要的线索。一、REV感染外周血淋巴细胞对天然免疫相关基因转录的影响为了明确REV感染对鸡外周血淋巴细胞中天然免疫应答的影响,利用荧光定量PCR方法检测REV感染SPF鸡外周血淋巴细胞后天然免疫相关基因表达情况,包括Toll样受体(TLR3、TLR4、TLR7、TLR15 和 TLR21)、信号通路相关细胞因子(IRF7、MDA5、MyD88、MDA5、NF-κB、IRAK4、TRAF6、TRIF 和 TAK1)、炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和IL-18)、抗病毒相关细胞因子(IFN-α、IFN-β、IFN-ν、iNOS、MHC I和OASL)等基因在感染后12h、24h、48h和72h的转录水平变化情况。实验结果表明,REV感染SPF鸡外周血淋巴细胞后72h以内,TLR3、TLR4和TLR7的mRNA转录水平明显降低;而 TLR15 和 TLR21 的 mRNA 转录水平变化不大。IRF7、IRAK4、NF-κB、TRAF6、TRIF、TAKI和MHC I转录水平表达变化与TLR3趋势一致;而MyD88、IL-10、IL-18、MDA5、IFN-β、iNOS和OASL在感染72h时表达上调;IL-lβ、IL-6和IL-8转录水平显著升高,在72h时达到峰值;IFN-α在感染48h表达稍有抑制,IFN-lγ则在感染初期12h时表达显著升高。以上结果表明REV在感染早期能够不同程度引起天然免疫受体TLR3、TLR4和TLR7的抑制,以及Toll样受体信号通路相关细胞因子的抑制;炎性细胞因子和抗肿瘤相关细胞因子不同程度的表达上调,这些结果为进一步解释REV的免疫抑制机制提供依据。二、REV感染SPF鸡主要免疫器官中免疫相关分子的表达情况为了解REV感染宿:主毕期的天然免疫反应,本研究进行了REV人工接种SPF鸡动物实验。实验分为感染组和对照组,在感染后的第1、3、5、7、14、21、28和35天分别采集外周血淋巴细胞、胸腺、脾脏、法氏囊和盲肠扁桃体等免疫器官和细胞,通过荧光定量PCR检测病毒的复制情况以及天然免疫受体(TLR3和TLR7)、炎性因子(IL-1β和IL-6)和干扰素(IFN-α、IFN-β和IFN-γ)的表达情况。结果显示REV感染后,病毒含量的变化呈现先增后减,再增再减的趋势。在胸腺中,第14天时病毒的含量达到最高;在外周血淋巴细胞、脾脏、法氏囊和盲肠扁桃体中,第7天时病毒的含量达到最高:在第28天时,病毒的含量又开始增加。天然免疫受体(TLR3和TLR7)和II型干扰素(IFN-γ)在病毒大量复制时,表达量也上升;炎性因子(IL-6和IL-1β)的表达变化在外周血淋巴细胞、脾脏和法氏囊中趋势与病毒复制一致;在感染脾脏第28天和法氏囊第14天和第28天中I型干扰素(IFN-α和IFN-β)表达上调,此时的病毒含量也是最高。这些实验结果表明了REV感染宿主免疫器官早期的免疫反应情况,为深入研究病毒感染引起的免疫抑制机理提供基础。三、REV感染SPF鸡法氏囊转录组学的研究REV感染鸡只可引起免疫抑制,混合感染和继发感染,导致临床较高的死亡率。然而,病毒与宿主之间的相互作用知之甚少。本研究旨在通过REV感染的法氏囊组织基因转录组学分析,反应病毒与宿主之间的互作关系。经第二部分实验结果以及相关参考文献可以得知,REV感染SPF鸡后病毒含量在法氏囊中达到最高值,因此选择法氏囊作为转录组学分析的研究对象。生物信息学分析表明,在REV感染后总共有15296个差异表达基因,这些表达差异基因涉及细胞过程、结合、生物学调节、代谢加工、刺激反应和免疫系统等方面。通过KEGG信号通路分析发现,差异表达基因主要参与了免疫、肿瘤和代谢相关的信号通路,如Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、NOD样受体信号通路和Metabolic信号通路等。本研究获得的REV HA110I株感染鸡法氏囊转录组学为更好的解释REV感染的分子机制提供了理论基础。四、天然免疫受体的配体对REV复制的影响Toll样受体以识别病原相关分子模式为基础,感知病原微生物的存在,激活胞内的信号转导,导致下游信号通路的激活,再通过产生炎性细胞因子、I型干扰素和其他炎性介质来诱导免疫应答。因此,Toll样受体在诱导宿主对病原体的反应中起着重要作用。Toll样受体的配体刺激能引起相应免疫反应,从而防止细菌和病毒病原体的感染。本研究根据前期实验结果,选择TLR3和TLR7的配体刺激细胞,检测REV复制情况的变化。实验结果表明,TLR3和TLR7的配体刺激CEF细胞均能抑制REV在细胞中的复制,其中TLR3配体的作用更加明显,且这种病毒抑制作用可能与细胞中抗病毒细胞因子高表达相关。