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牙周病造成牙周附着结构丧失,牙槽骨吸收,是成年人失牙的主要原因,严重影响患者身心健康。因此,牙周附着组织的再生是牙周病治疗的主要目标。目前引导牙周组织再生术(guide tissue regeneration, GTR)取得了较好的效果。它是将一种屏障性材料放于牙根和牙龈瓣之间,阻挡牙龈成纤维细胞和上皮细胞长入,从而使具有再生潜能的牙周韧带细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)优先占据根面空间,依靠其分化形成牙周组织。这种技术从临床上和动物实验中均证实能够形成牙周新附着。然而长期的牙周病损使剩余的牙周韧带细胞数量减少,不能满足完全的修复再生。因此,我们需要补充一定量的种子细胞到牙周缺损区以弥补自身细胞数量的不足。在本课题中,我们将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的大鼠成骨细胞,接种至三维多孔支架壳聚糖/纳米羟基磷灰石(chito san/hydroxyapatite, CS/nHA)膜上,植入大鼠颅顶骨缺损,观察其是否既具有屏障膜功能又能提供细胞来源,为负载种子细胞的壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合膜在牙周引导组织再生术中的应用提供实验依据。研究方法：1、自SD大鼠颅顶骨取材,通过酶消化培养法获取原代成骨细胞,体外培养,适时传代。MTT法观察其增殖过程,绘制出生长曲线。进行碱性磷酸酶染色和von kossa染色以确定其成骨细胞特性,将生长状态良好的成骨细胞进行EGFP基因转染并扩增。2、将EGFP转染阳性的的成骨细胞接种在CS/nHA上构建复合膜,应用扫描电镜、荧光显微镜观察成骨细胞在CS/nHA复合膜上的生长状况。3、将12只雄性成年SD大鼠随机分成两组,于颅骨顶部双侧各制备直径5mm大小圆形穿通骨缺损模型,实验组骨缺损植入负载转染EGFP+成骨细胞的CS/nHA复合膜,并覆盖缺损边缘2-3mm；空白对照组骨缺损区不植入任何材料,缝合伤口。术后16周处死两组动物,取颅盖骨标本固定、包埋、切片,行HE染色、Masson染色和免疫组化染色,组织学和荧光显微镜观察EGFP+成骨细胞的分布和颅骨缺损处骨修复状况。结果：1、体外培养的成骨细胞具有良好的生长能力,贴壁生长,呈多角形、梭形。碱性磷酸酶染色和von kossa染色阳性。冻存复苏后形态与原代细胞类似,具有旺盛的增殖能力。2、扫描电镜、荧光显微镜发现转染EGFP基因的成骨细胞在CS/nHA复合膜材料上生长状况良好。3、组织学观察：实验组：观察到新生组织较致密,充满骨缺损区。表面为纤维结缔组织,其中散在分布着未降解的膜材料,在其下部,骨缺损区的边缘和中央可见散在的新骨形成,大量的成骨细胞聚集在新生骨组织周围。空白对照组：为一薄层的纤维组织充满骨缺损。4、免疫组化染色观察在新生骨小梁表面有大量GFP表达阳性的细胞。5、荧光显微镜观察在新生骨组织周围有呈现较强的绿色荧光的成骨细胞分布。结论：植入的成骨细胞参与骨缺损处修复,为骨缺损修复提供细胞来源；壳聚糖／纳米羟基磷灰石膜与成骨细胞复合能够有效的修复骨缺损。以上结果提示种子细胞与复合膜用于牙周骨缺损可能会取得较好的效果。