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摘要[目的]研究大孔树脂柱层析法纯化红芸豆种皮花色苷的条件并对纯化产物进行高效液相色谱（HPLC）分析。[方法]通过静态吸附和解吸试验比较了AB-8、D101、SP825、NKA-9、XAD-16和HPD100这6种不同类型大孔树脂对红芸豆种皮花色苷的吸附和洗脱性能，优化了AB-8树脂纯化红芸豆种皮花色苷的工艺，HPLC对比分析纯化产物与粗提物。[结果]AB-8大孔树脂对红芸豆种皮花色苷吸附和洗脱性能较好，最佳上样流速为3.0 BV/h。最佳洗脱条件为pH 1.0、100%乙醇作为洗脱液，洗脱流速为4.5 BV/h，得到的花色苷纯度达86.05%。HPLC检测结果表明纯化效果明显。[结论]AB-8大孔树脂可有效分离红芸豆种皮花色苷。
关键词红芸豆；花色苷；大孔树脂；纯化；HPLC
中图分类号TS264.4文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）26-0011-04
Purification of Anthocyanins from Seed Coat of Red Kidney Bean （Phaseolus vulgaris L.） by Macroporous Adsorption Resin
HAO Ruilin1，TAN Wufang1，DONG Qianqian1，FAN Jianfeng2*（1.Department of Biology，Xinzhou Teachers’ University，Xinzhou，Shanxi 034000；2.Department of Chemistry，Xinzhou Teachers’ University，Xinzhou，Shanxi 034000）
Abstract[Objective] The aim was to study purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean by macroporous adsorption resin.[Method] The static adsorption and desorption characteristics of macroporous adsorption resins including AB8，D101，SP825，NKA9，XAD16 and HPD100 for anthocyanins were investigated and the purification technology of anthocyanins by AB8 macroporou adsorption resin were optimized.And the HPLC technology were applied to analyze the purified.[Result] Resin AB8 showed a satisfactory adsorptiondesorption capacity for purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean.The optimized purification condition as the flow rate of adsorption solution was 3.0 BV/h，and the optimized desorption solution was 100% ethanol （modified to pH 1.0 by hydrochloric acid） with the flow rate of 4.5 BV/h.The purified powder owned a purity of 86.05% and HPLC method proved the purification was effective.[Conclusion] The developed method can be applied to the purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean.
Key wordsRed kidney bean；Anthocyanins；Mmacroporou adsorption resin；Purification；HPLC
花色苷屬黄酮类化合物，主要分布在植物表皮细胞的液泡中，是植物呈现蓝色、紫色、红色和黄色的主要原因[1-2]。目前已有超过500种天然花色苷被发现，其基本构成苷元为矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、矮牵牛色素、锦葵色素[3-4]。研究发现花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、修复胰岛组织损伤等生理功效，在心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病等的预防和治疗领域有广泛的应用前景[5]。红芸豆（Phaseolus vulgaris L.）属蝶形花科菜豆属，色泽鲜艳且含有丰富的蛋白质、维生素及钙、铁、镁等微量元素[6]。大孔树脂柱层析是目前从植物粗提物中分离、精制黄酮类化合物时应用最广泛的技术，具有吸附容量大、分离速度快、再生简便、生产成本低等优点[7]。笔者对应用大孔树脂柱层析初步纯化红芸豆种皮中花色苷的条件进行了研究，旨在为红芸豆的开发利用和深加工提供参考。
1材料与方法
1.1材料红芸豆购自岢岚县农贸市场。JY92-IIDN超声波细胞破碎仪购自江苏省昆山市超声仪器有限公司；UV-2250紫外可见光谱仪购自日本岛津公司；SH2-D（Ⅲ）循环水真空泵、RE-52AA旋转蒸发仪购自河南省巩义市予华仪器有限公司；DZF-6050真空干燥箱购自上海龙跃仪器设备有限公司；SCIENTZ-10N低温冷冻干燥机购自浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；BS-100A 自动部分收集器、BT-100恒流泵购自上海泸西分析仪器厂有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪购自日本岛津公司。AB-8、D101、NKA-9购于天津市光复精细化工研究所，其余树脂购于上海摩速科学器材有限公司。 1.2方法
1.2.1红芸豆种皮花色苷的提取。
红芸豆筛选洗净后剥皮，将红芸豆皮在30 ℃、0.05 MPa条件下真空干燥后粉碎，过60目筛，经单因素试验和响应面优化设计，确定以40%乙醇（浓盐酸调pH 1.0）为提取剂，料液比1∶24，68 ℃、160 W超声波辅助提取78 min时，花色苷得率最大为1 855.70 g/kg。将粗提液4 000 r/min、20 min离心后取上清，50 ℃减压蒸发除去乙醇后得到花色苷含量为50.27 mg/L的提取液，置于 4 ℃冰箱备用。
1.2.2花色苷浓度测定。
pH示差法测定花色苷得率[8]：红芸豆种皮花色苷浓度以矢车菊素-3-葡萄糖苷计，取2 mL上清液用pH 1.0、0.025 mol/L氯化钾缓冲液稀释至25 mL，另取2 mL上清液用pH 4.5、0.4 mol/L醋酸钠缓冲液稀释至25 mL。分别测定稀释液517、700 nm波长处吸光值，记作A517与A700。按公式（1）计算花色苷浓度：
C=A×449.2×1 000×DF26 900（1）
式（1）中，C为花色苷质量浓度（mg/L）；A=（A525-A700）pH 1.0-（A525-A700）pH 4.5；449.2为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子量；DF为稀释倍数；26 900为摩尔消光系数。
1.2.3树脂的预处理与再生。
将树脂用2倍体积无水乙醇浸泡24 h，待树脂充分溶胀后装柱，无水乙醇洗至流出液不再浑浊，蒸馏水洗脱至无乙醇味，浸于蒸馏水中备用[9]。
1.2.4树脂的筛选。
分别取处理好的树脂各1 g置于锥形瓶，加入花色苷浓度为50.27 mg/L的粗提液100 mL，封口，置于25 ℃水浴恒温振荡器，100 r/min 振荡吸附12 h后测定溶液中花色苷含量。吸附饱和后，过滤树脂除去残留花色苷，加入100 mL 60%乙醇溶液（盐酸调pH为1.0），25 ℃、100 r/min 振荡解吸附，定时从上清液取样，测定上清中花色苷质量浓度，按照公式（2）和（3）计算树脂的吸附量与解吸率，重复试验3次。
静态吸附量（mg/g）=（C0-C1）/10 （2）
静态解吸率=（C0-C1）/C2×100% （3）
式（2）、（3）中，C0为提取液花色苷的初始浓度（mg/L）；C1为吸附平衡后的溶液中花色苷浓度（mg/L）；C2为解吸液花色苷浓度（mg/L）。
1.2.5AB-8树脂对红芸豆种皮花色苷的静态吸附动力学。
称取处理好的AB-8大孔树脂1 g，置于锥形瓶中，加入浓度为50.27 mg/L的红芸豆种皮花色苷粗提液100 mL，置于25 ℃水浴恒温振荡器，100 r/min振荡吸附，分别在15、30、45、60、120、180、240、300 min时取样，按公式（2）计算吸附量，并繪制AB-8大孔树脂对红芸豆种皮花色苷的吸附动力学曲线[10]。
1.2.6动态吸附条件选择。
在Ф1.0 cm×50.0 cm玻璃柱中装入处理好的AB-8树脂至柱高为12.7 cm（约10 mL），红芸豆花色苷提取液以不同流速上样至吸附饱和，每隔一定时间收集流出液，按公式（1）计算每份流出液花色苷质量浓度及合并后的流出液中花色苷的浓度，绘制动态吸附曲线，按公式（4）计算动态吸附量，并以上样流速对动态吸附量作图[11]。
动态吸附量（mg/mL）=（Cs-C3总）×Vs/10 000 （4）
式（4）中， Cs为上样液中花色苷含量（mg/L）；C3总为合并后流出液中花色苷含量（mg/L）；Vs为上样液体积（mL）。
1.2.7动态解吸附条件选择。
在Ф1.0 cm×50.0 cm玻璃柱中装入动态吸附饱和的AB-8树脂至柱高为12.7 cm（约10 mL）。分别用不同体积分数的乙醇溶液（浓盐酸调pH为1.0）以3.0 BV/h的流速洗脱8 BV，考察洗脱液中乙醇浓度对解吸效果的影响；用60%乙醇（浓盐酸调pH为1.0）以不同的流速洗脱8 BV，考察洗脱流速对解吸效果的影响。每隔一定时间收集洗脱液，测定每份洗脱液中花色苷质量浓度及合并后洗脱液中花色苷质量浓度，绘制动态解吸曲线，按照公式（5）计算动态解吸率并分别以乙醇体积分数及洗脱流速对动态解吸率作图[12]。
动态解吸率=C4总V4（Cs-C3总）Vs×100%（5）
式（5）中， C4总为合并后洗脱液中花色苷含量（mg/L）；V4为洗脱液总体积（mL）。
1.2.8纯化产物纯度的测定。
经大孔树脂柱层析纯化后，花色苷洗脱液30 ℃减压浓缩，冻干成粉。称取20 mg花色苷粉末，用pH 1.0甲醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中，利用pH示差法测定该溶液的花色苷浓度，用公式（6）计算产物纯度[13]。
产物纯度=C/200×100% （6）
式（6）中，C为测定花色苷质量浓度（mg/L）。
1.2.9 HPLC检测条件。
参考Jampani 等[14]的方法并稍作修改，采用Wondasil C18柱（250 nm×4.6 mm，5 μm），检测温度25 ℃，流速1 mL/min，进样体积20 μL，A相为5%甲酸水溶液，B相乙腈，检测波长为525 nm，洗脱条件：0～5 min，5% B；5～12 min，5%～12% B；12～20 min，12%～18% B；20～70 min，18%～70% B；70～80 min，70% B；80～85 min，70%～100% B；85.01 min，5% B。 1.3数据处理试验数据采用SPSS软件作图，利用Design-Expert 8.0.6进行方差分析。
2结果与分析
2.1红芸豆种皮花色苷乙醇提取液最大吸收波长的确定
图1为红芸豆种皮花色苷提取液（pH=1.0，含40%乙醇）在400～700 nm波长处的吸收光谱。由图1可见，用酸性乙醇提取的红芸豆种皮花色苷溶液在可见光区最大吸收波长λmax为517 nm。
2.2红芸豆种皮花色苷纯化工艺研究
花色苷粗提取液中通常包含有大量的多糖、有机酸、矿物质及其他的水溶性杂质[15]。大孔树脂理化性质稳定，不溶于水、酸、碱及甲醇、乙醇等常用有机溶剂。树脂内部分布有网状孔穴，因而具有较高的比表面积和吸附能力。同时，树脂合成时通过引入酰胺基、酚羟基等极性基团从而使树脂具有极性化合物吸附能力进而具备较强的分离能力。常用于花色苷类物质纯化的大孔树脂有AB-8、HP-20、NKA-9、HPD-700、D-101等[16-20]。
2.2.1树脂吸附性能的比较。
由图2（A）可见，AB-8树脂对红芸豆种皮花色苷吸附能力最强，12 h吸附量为0.63 mg/g，其次为D101和XAD-16树脂。由图2（B）可见，采用pH 1.0、60%乙醇洗脱时， AB-8树脂的解吸率最高达92.11%，且解吸速率快，3 h解吸率达90%。XAD-16树脂解吸率最低，9 h解吸率为63.43%。综合静态吸附和解吸试验结果，选择AB-8树脂作为红芸豆种皮花色苷纯化介质。
2.2.2AB-8大孔吸附树脂静态吸附动力学曲线。
由图3可见，在1 h内，AB-8树脂对红芸豆种皮花色苷的吸附量随时间的延长而快速增加，1 h时吸附量达0.51 mg/g，超过1 h后，吸附速率下降，3 h时逐渐达到吸附平衡，之后随着时间的延长，吸附量缓慢增加。
2.2.3上样流速对吸附效果的影响。
由图4可见，上样流速越快，泄漏越快，吸附量越小，吸附效果越差。以9 BV/h的流速上样时，15 min即可达到吸附饱和，但AB-8树脂对红芸豆种皮花色苷的吸附量只有0.29 mg/g，以3 BV/h的流速上样时，达到吸附饱和需要45 min，吸附量达0.59 mg/g，因此选择3.0 BV/h为最佳上样流速。
2.2.5洗脱速率对解吸效果的影响。
由图6可见，当洗脱体积达到8.0 BV时，9.0 BV/h流速下洗脱速度最快，40 min洗脱完成。1.5 BV/h洗脱速度最慢，300 min才洗脱完成。由图7可见，解吸率随洗脱流速的增加呈先增大后降低的趋势，当流速为4.5 BV/h时解吸率最大为81.41%。综合分析选择4.5 BV/h为最佳洗脱流速，最小洗脱剂量为6.0 BV。
2.2.6花色苷纯度。
红芸豆种皮花色苷提取液经AB-8大孔树脂柱层析纯化后，经30 ℃减压浓缩除去乙醇，再经冷冻干燥后成为暗红色粉末，经检测其纯度达86.05%。
2.3纯化产物的HPLC分析
由图8可见，该试验条件下粗提物有6个主要组分峰。由图9可见，纯化产物有3个主要组分峰。图8与图9对比可知，经过AB-8大孔树脂纯化后，杂峰有效减少，同时发现保留时间超过50 min的2个组分峰显著减少，可能是由于这2种组分与大孔吸附树脂形成较强的分子间作用力，导致洗脱剂无法有效洗脱。
3结论
红芸豆种皮色泽艳丽，含有丰富的花色苷。花色苷作为天然色素具有食用安全性高、多种生理功能、色调自然等特点，因而在食品和保健品领域扮演重要的角色。该研究以红芸豆种皮为原料，研究和优化了大孔树脂柱层析纯化红芸豆种皮花色苷的方法，并对纯化产物的纯度和成分进行分析，
为红芸豆的开发利用提供了参考。
AB-8大孔树脂对红芸豆种皮花色苷具有良好的吸附与解吸性能。采用AB-8大孔树脂柱层析法纯化红芸豆种皮花色苷时上样流速宜选择3.0 BV/h，采用100%乙醇（浓盐酸调pH为1.0）以4.5 BV/h洗脱6 BV时解吸率最高，產品纯度可达86.05%。HPLC对比分析提取物与纯化产物发现纯化效果明显。
参考文献
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科技论文写作规范——讨论
着重于研究中新的发现和重要方面，以及从中得出的结论。不必重复在结果中已评述过的资
料，也不要用模棱两可的语言，或随意扩大范围，讨论与文中无多大关联的内容。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（26）：15-17，20
关键词红芸豆；花色苷；大孔树脂；纯化；HPLC
中图分类号TS264.4文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）26-0011-04
Purification of Anthocyanins from Seed Coat of Red Kidney Bean （Phaseolus vulgaris L.） by Macroporous Adsorption Resin
HAO Ruilin1，TAN Wufang1，DONG Qianqian1，FAN Jianfeng2*（1.Department of Biology，Xinzhou Teachers’ University，Xinzhou，Shanxi 034000；2.Department of Chemistry，Xinzhou Teachers’ University，Xinzhou，Shanxi 034000）
Abstract[Objective] The aim was to study purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean by macroporous adsorption resin.[Method] The static adsorption and desorption characteristics of macroporous adsorption resins including AB8，D101，SP825，NKA9，XAD16 and HPD100 for anthocyanins were investigated and the purification technology of anthocyanins by AB8 macroporou adsorption resin were optimized.And the HPLC technology were applied to analyze the purified.[Result] Resin AB8 showed a satisfactory adsorptiondesorption capacity for purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean.The optimized purification condition as the flow rate of adsorption solution was 3.0 BV/h，and the optimized desorption solution was 100% ethanol （modified to pH 1.0 by hydrochloric acid） with the flow rate of 4.5 BV/h.The purified powder owned a purity of 86.05% and HPLC method proved the purification was effective.[Conclusion] The developed method can be applied to the purification of anthocyanins from seed coat of red kidney bean.
Key wordsRed kidney bean；Anthocyanins；Mmacroporou adsorption resin；Purification；HPLC
花色苷屬黄酮类化合物，主要分布在植物表皮细胞的液泡中，是植物呈现蓝色、紫色、红色和黄色的主要原因[1-2]。目前已有超过500种天然花色苷被发现，其基本构成苷元为矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、矮牵牛色素、锦葵色素[3-4]。研究发现花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、修复胰岛组织损伤等生理功效，在心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病等的预防和治疗领域有广泛的应用前景[5]。红芸豆（Phaseolus vulgaris L.）属蝶形花科菜豆属，色泽鲜艳且含有丰富的蛋白质、维生素及钙、铁、镁等微量元素[6]。大孔树脂柱层析是目前从植物粗提物中分离、精制黄酮类化合物时应用最广泛的技术，具有吸附容量大、分离速度快、再生简便、生产成本低等优点[7]。笔者对应用大孔树脂柱层析初步纯化红芸豆种皮中花色苷的条件进行了研究，旨在为红芸豆的开发利用和深加工提供参考。
1材料与方法
1.1材料红芸豆购自岢岚县农贸市场。JY92-IIDN超声波细胞破碎仪购自江苏省昆山市超声仪器有限公司；UV-2250紫外可见光谱仪购自日本岛津公司；SH2-D（Ⅲ）循环水真空泵、RE-52AA旋转蒸发仪购自河南省巩义市予华仪器有限公司；DZF-6050真空干燥箱购自上海龙跃仪器设备有限公司；SCIENTZ-10N低温冷冻干燥机购自浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；BS-100A 自动部分收集器、BT-100恒流泵购自上海泸西分析仪器厂有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪购自日本岛津公司。AB-8、D101、NKA-9购于天津市光复精细化工研究所，其余树脂购于上海摩速科学器材有限公司。 1.2方法
1.2.1红芸豆种皮花色苷的提取。
红芸豆筛选洗净后剥皮，将红芸豆皮在30 ℃、0.05 MPa条件下真空干燥后粉碎，过60目筛，经单因素试验和响应面优化设计，确定以40%乙醇（浓盐酸调pH 1.0）为提取剂，料液比1∶24，68 ℃、160 W超声波辅助提取78 min时，花色苷得率最大为1 855.70 g/kg。将粗提液4 000 r/min、20 min离心后取上清，50 ℃减压蒸发除去乙醇后得到花色苷含量为50.27 mg/L的提取液，置于 4 ℃冰箱备用。
1.2.2花色苷浓度测定。
pH示差法测定花色苷得率[8]：红芸豆种皮花色苷浓度以矢车菊素-3-葡萄糖苷计，取2 mL上清液用pH 1.0、0.025 mol/L氯化钾缓冲液稀释至25 mL，另取2 mL上清液用pH 4.5、0.4 mol/L醋酸钠缓冲液稀释至25 mL。分别测定稀释液517、700 nm波长处吸光值，记作A517与A700。按公式（1）计算花色苷浓度：
C=A×449.2×1 000×DF26 900（1）
式（1）中，C为花色苷质量浓度（mg/L）；A=（A525-A700）pH 1.0-（A525-A700）pH 4.5；449.2为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子量；DF为稀释倍数；26 900为摩尔消光系数。
1.2.3树脂的预处理与再生。
将树脂用2倍体积无水乙醇浸泡24 h，待树脂充分溶胀后装柱，无水乙醇洗至流出液不再浑浊，蒸馏水洗脱至无乙醇味，浸于蒸馏水中备用[9]。
1.2.4树脂的筛选。
分别取处理好的树脂各1 g置于锥形瓶，加入花色苷浓度为50.27 mg/L的粗提液100 mL，封口，置于25 ℃水浴恒温振荡器，100 r/min 振荡吸附12 h后测定溶液中花色苷含量。吸附饱和后，过滤树脂除去残留花色苷，加入100 mL 60%乙醇溶液（盐酸调pH为1.0），25 ℃、100 r/min 振荡解吸附，定时从上清液取样，测定上清中花色苷质量浓度，按照公式（2）和（3）计算树脂的吸附量与解吸率，重复试验3次。
静态吸附量（mg/g）=（C0-C1）/10 （2）
静态解吸率=（C0-C1）/C2×100% （3）
式（2）、（3）中，C0为提取液花色苷的初始浓度（mg/L）；C1为吸附平衡后的溶液中花色苷浓度（mg/L）；C2为解吸液花色苷浓度（mg/L）。
1.2.5AB-8树脂对红芸豆种皮花色苷的静态吸附动力学。
称取处理好的AB-8大孔树脂1 g，置于锥形瓶中，加入浓度为50.27 mg/L的红芸豆种皮花色苷粗提液100 mL，置于25 ℃水浴恒温振荡器，100 r/min振荡吸附，分别在15、30、45、60、120、180、240、300 min时取样，按公式（2）计算吸附量，并繪制AB-8大孔树脂对红芸豆种皮花色苷的吸附动力学曲线[10]。
1.2.6动态吸附条件选择。
在Ф1.0 cm×50.0 cm玻璃柱中装入处理好的AB-8树脂至柱高为12.7 cm（约10 mL），红芸豆花色苷提取液以不同流速上样至吸附饱和，每隔一定时间收集流出液，按公式（1）计算每份流出液花色苷质量浓度及合并后的流出液中花色苷的浓度，绘制动态吸附曲线，按公式（4）计算动态吸附量，并以上样流速对动态吸附量作图[11]。
动态吸附量（mg/mL）=（Cs-C3总）×Vs/10 000 （4）
式（4）中， Cs为上样液中花色苷含量（mg/L）；C3总为合并后流出液中花色苷含量（mg/L）；Vs为上样液体积（mL）。
1.2.7动态解吸附条件选择。
在Ф1.0 cm×50.0 cm玻璃柱中装入动态吸附饱和的AB-8树脂至柱高为12.7 cm（约10 mL）。分别用不同体积分数的乙醇溶液（浓盐酸调pH为1.0）以3.0 BV/h的流速洗脱8 BV，考察洗脱液中乙醇浓度对解吸效果的影响；用60%乙醇（浓盐酸调pH为1.0）以不同的流速洗脱8 BV，考察洗脱流速对解吸效果的影响。每隔一定时间收集洗脱液，测定每份洗脱液中花色苷质量浓度及合并后洗脱液中花色苷质量浓度，绘制动态解吸曲线，按照公式（5）计算动态解吸率并分别以乙醇体积分数及洗脱流速对动态解吸率作图[12]。
动态解吸率=C4总V4（Cs-C3总）Vs×100%（5）
式（5）中， C4总为合并后洗脱液中花色苷含量（mg/L）；V4为洗脱液总体积（mL）。
1.2.8纯化产物纯度的测定。
经大孔树脂柱层析纯化后，花色苷洗脱液30 ℃减压浓缩，冻干成粉。称取20 mg花色苷粉末，用pH 1.0甲醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中，利用pH示差法测定该溶液的花色苷浓度，用公式（6）计算产物纯度[13]。
产物纯度=C/200×100% （6）
式（6）中，C为测定花色苷质量浓度（mg/L）。
1.2.9 HPLC检测条件。
参考Jampani 等[14]的方法并稍作修改，采用Wondasil C18柱（250 nm×4.6 mm，5 μm），检测温度25 ℃，流速1 mL/min，进样体积20 μL，A相为5%甲酸水溶液，B相乙腈，检测波长为525 nm，洗脱条件：0～5 min，5% B；5～12 min，5%～12% B；12～20 min，12%～18% B；20～70 min，18%～70% B；70～80 min，70% B；80～85 min，70%～100% B；85.01 min，5% B。 1.3数据处理试验数据采用SPSS软件作图，利用Design-Expert 8.0.6进行方差分析。
2结果与分析
2.1红芸豆种皮花色苷乙醇提取液最大吸收波长的确定
图1为红芸豆种皮花色苷提取液（pH=1.0，含40%乙醇）在400～700 nm波长处的吸收光谱。由图1可见，用酸性乙醇提取的红芸豆种皮花色苷溶液在可见光区最大吸收波长λmax为517 nm。
2.2红芸豆种皮花色苷纯化工艺研究
花色苷粗提取液中通常包含有大量的多糖、有机酸、矿物质及其他的水溶性杂质[15]。大孔树脂理化性质稳定，不溶于水、酸、碱及甲醇、乙醇等常用有机溶剂。树脂内部分布有网状孔穴，因而具有较高的比表面积和吸附能力。同时，树脂合成时通过引入酰胺基、酚羟基等极性基团从而使树脂具有极性化合物吸附能力进而具备较强的分离能力。常用于花色苷类物质纯化的大孔树脂有AB-8、HP-20、NKA-9、HPD-700、D-101等[16-20]。
2.2.1树脂吸附性能的比较。
由图2（A）可见，AB-8树脂对红芸豆种皮花色苷吸附能力最强，12 h吸附量为0.63 mg/g，其次为D101和XAD-16树脂。由图2（B）可见，采用pH 1.0、60%乙醇洗脱时， AB-8树脂的解吸率最高达92.11%，且解吸速率快，3 h解吸率达90%。XAD-16树脂解吸率最低，9 h解吸率为63.43%。综合静态吸附和解吸试验结果，选择AB-8树脂作为红芸豆种皮花色苷纯化介质。
2.2.2AB-8大孔吸附树脂静态吸附动力学曲线。
由图3可见，在1 h内，AB-8树脂对红芸豆种皮花色苷的吸附量随时间的延长而快速增加，1 h时吸附量达0.51 mg/g，超过1 h后，吸附速率下降，3 h时逐渐达到吸附平衡，之后随着时间的延长，吸附量缓慢增加。
2.2.3上样流速对吸附效果的影响。
由图4可见，上样流速越快，泄漏越快，吸附量越小，吸附效果越差。以9 BV/h的流速上样时，15 min即可达到吸附饱和，但AB-8树脂对红芸豆种皮花色苷的吸附量只有0.29 mg/g，以3 BV/h的流速上样时，达到吸附饱和需要45 min，吸附量达0.59 mg/g，因此选择3.0 BV/h为最佳上样流速。
2.2.5洗脱速率对解吸效果的影响。
由图6可见，当洗脱体积达到8.0 BV时，9.0 BV/h流速下洗脱速度最快，40 min洗脱完成。1.5 BV/h洗脱速度最慢，300 min才洗脱完成。由图7可见，解吸率随洗脱流速的增加呈先增大后降低的趋势，当流速为4.5 BV/h时解吸率最大为81.41%。综合分析选择4.5 BV/h为最佳洗脱流速，最小洗脱剂量为6.0 BV。
2.2.6花色苷纯度。
红芸豆种皮花色苷提取液经AB-8大孔树脂柱层析纯化后，经30 ℃减压浓缩除去乙醇，再经冷冻干燥后成为暗红色粉末，经检测其纯度达86.05%。
2.3纯化产物的HPLC分析
由图8可见，该试验条件下粗提物有6个主要组分峰。由图9可见，纯化产物有3个主要组分峰。图8与图9对比可知，经过AB-8大孔树脂纯化后，杂峰有效减少，同时发现保留时间超过50 min的2个组分峰显著减少，可能是由于这2种组分与大孔吸附树脂形成较强的分子间作用力，导致洗脱剂无法有效洗脱。
3结论
红芸豆种皮色泽艳丽，含有丰富的花色苷。花色苷作为天然色素具有食用安全性高、多种生理功能、色调自然等特点，因而在食品和保健品领域扮演重要的角色。该研究以红芸豆种皮为原料，研究和优化了大孔树脂柱层析纯化红芸豆种皮花色苷的方法，并对纯化产物的纯度和成分进行分析，
为红芸豆的开发利用提供了参考。
AB-8大孔树脂对红芸豆种皮花色苷具有良好的吸附与解吸性能。采用AB-8大孔树脂柱层析法纯化红芸豆种皮花色苷时上样流速宜选择3.0 BV/h，采用100%乙醇（浓盐酸调pH为1.0）以4.5 BV/h洗脱6 BV时解吸率最高，產品纯度可达86.05%。HPLC对比分析提取物与纯化产物发现纯化效果明显。
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科技论文写作规范——讨论
着重于研究中新的发现和重要方面，以及从中得出的结论。不必重复在结果中已评述过的资
料，也不要用模棱两可的语言，或随意扩大范围，讨论与文中无多大关联的内容。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（26）：15-17，20