论文部分内容阅读
摘要 为研究RHDV VP60作为载体容纳外源片段以及递呈外源T细胞表位的能力，将双串联卵清蛋白T细胞表位插入N端、C端以及替代N端氨基酸的方式获得3种嵌合蛋白，进行免疫试验。3种嵌合蛋白分别命名为DN1、DN2和DC，将蛋白进行浓缩、纯化及定量，利用透射电镜观察VLPs的形成，发现均可形成形态大小与VP60相似的VLPs。将3种嵌合蛋白分别腹腔注射C57BL/6雌性小鼠，利用间接ELISA检测首免后0、4和6周小鼠血清样品中VP60特异性抗体，结果表明嵌合蛋白组与VP60组均能够诱导产生较高水平的抗VP60特异性抗体，2组间无显著差异。首免后6周，利用合成的OVA多肽刺激脾淋巴细胞，ELISPOT检测特异性IFNγ的分泌水平，结果表明3种嵌合蛋白均能诱导特异性IFNγ的分泌。该研究扩展了VP60作为载体可携带的外源片段的耐受性及有效递呈T细胞表位的能力，为VP60VLPs展示系统的研究提供了理论依据。
关键词 RHDV；衣壳蛋白；OVA T细胞表位；嵌合蛋白；免疫原性研究
中图分类号 S858.29 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）32-089-04
Abstract Three chimeric RHDVVLPs incorporating double CD+8 Tcell epitopes derived from chicken ovalbumin （OVA） were constructed. Two integrations were performed by replacing aa.2-13 （DN2） and 302-309 （DC） of VP60 with OVA epitopes respectively， and another one was generated by inserting the epitopes into Nterminus of VP60 （DN1）. Three chimeric proteins were expressed in baculovirus system and selfassembled into VLPs correctly. Three chimeric proteins could induce high levels of antiVP60 specific antibody and specific IFNγ production in the murine model. The antiVP60 specific antibody titers of chimeric proteins groups were comparable with that in group VP60. Chimeric proteins groups showed significant higher productions of specific IFNγthan that in group VP60. Our result indicated that insertions or replacement of foreign epitopes at the specific locations of VP60 could effectively induce cellular immune responses. The manuscript should be very valuable for using RHDVVLPs as a carrier for foreign sequences.
Key words Rabbit hemorrhagic disease virus； Capsid protein （VP60）； OVA Tcell epitope； Chimeric protein； Immunogenicity
兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种具有高度传染性、高发病率、高致死性的疾病，是兔的一种毁灭性传染病[1-2]。该病在世界各地都有发生，在欧洲和东亚地区呈地方性流行[3-5]。兔出血症的病原RHDV是杯状病毒的成员之一，属于单链正股RNA病毒，基因组长约7.5 kb，其衣壳蛋白VP60可自行装配形成VLPs（Viruslike particles）[6-9]，是RHDV结构及免疫原性研究的重点[10-13]。目前，已有大量研究表明VP60 VLPs可以作为外源表位递呈载体和基因转移载体，为其发展成为携带多表位的载体疫苗提供依据[14-18]。
为进一步扩展RHDV VLPs作为载体容纳外源片段的长度以及作为载体有效递呈外源T细胞表位的能力，笔者将外源双串联CD+8T细胞表位，序列为GSSIINFEKLGSSIINFEKLGS，按照以下方式分别整合到VP60序列中：将双串联OVA CD+8 T细胞表位插入VP60 N末端；将双串联OVA CD+8 T细胞表位序列分别替换VP60蛋白的2～13AA和302～309AA，通过杆状病毒表达载体构建嵌合体，最终表达获得3种嵌合蛋白，分别命名为VP60DN1、VP60DN2和VP60DC[19-20]。在上述研究的基础上，笔者将获得嵌合蛋白进行浓缩纯化，选择特异性的C57BL/6雌性小鼠进行免疫试验，通过体液免疫应答和细胞免疫应答全面阐述VP60作为载体递呈外源表位的能力，进一步证实VP60 VLPs具有作为疫苗载体的潜在价值。
1 材料与方法
1.1 试剂、病毒和实验动物
重组杆状病毒rAcVBacVP60、rAcVBacDN1、rAcVBacDN2和rAcVBacDC由农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室构建并保存[2，19-20]。OVA CD+8 T细胞表位多肽由吉尔生化公司合成；ELISPOT试剂盒购自Mabtech公司。7～8周龄C57BL/6雌性小鼠购自扬州大学比较医学中心。 1.2 病毒样颗粒的电镜观察
将重组杆状病毒rAcVBacVP60、rAcVBacDN1、rAcVBacDN2和rAcVBacDC接种Sf9细胞，培养4～5 d待细胞完全病变后，分别收获细胞培养物，3 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用PBS重悬洗涤3次后，反复冻融3次，12 000 r/min离心5 min，取上清，用作电镜观察。将待检病毒培养物样品滴于载样铜网上，吸附作用2 min，将2%的磷钨酸染液滴于铜网上，固定2 min。室温干燥后用H7650型透射电镜对嵌合蛋白进行观察。
1.3 嵌合蛋白的制备
将4种重组杆状病毒分别以1%体积比接种于单层Sf9昆虫细胞，培养4～5 d待细胞完全病变后，分别收获细胞培养物，反复冻融3次后，5 000 g离心15 min去除细胞碎片，再次10 000 g离心30 min去除大的蛋白复合物和杆状病毒粒子，上清中的VLPs再次100 000 g离心2.5 h进行浓缩，4 ℃PBS重悬沉淀，进一步通过蔗糖密度梯度离心进行纯化，将样品铺于10%～50%蔗糖上，100 000 g 4 ℃离心2 h，吸取分界面的样品，再次超速离心100 000 g 4 ℃离心2 h除去蔗糖，沉淀用PBS重悬。利用BAC蛋白定量试剂盒测定纯化后重组蛋白的浓度，最终获得的重组蛋白分别命名为DN1、DN2、DC和VP60蛋白。
1.4 嵌合蛋白的免疫特性研究
1.4.1 动物免疫。
将嵌合蛋白DN1、DN2、DC以及VP60蛋白分别免疫7～8周龄C57BL/6雌性小鼠，每组5只，共免3次，每次间隔2周，免疫程序见表1。设置相同注射体积的PBS组作为空白对照组。于首免后0、4和6周对所有小鼠尾部采血分离血清，采用建立的间接ELISA方法[21]检测VP60特异性抗体滴度。于首免后6周将所有小鼠安乐死后分离脾淋巴细胞，用于检测特异性IFNγ分泌水平。
1.4.2 VP60特异性抗体效价的测定。
首免后0、4和6周对所有小鼠尾部采血分离血清，采用间接ELISA法检测各组小鼠血清中抗VP60的特异性抗体滴度。用pH 9.6包被液稀释VP60蛋白，4 ℃下包被过夜。脱脂乳37 ℃下封闭2 h。洗涤后每孔加入倍比稀释的待检血清，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h。加入1∶10 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h。加入显色液100 μl/孔，避光作用10 min，最后加入终止液，50 μl /孔。自动酶标仪测定OD450值，将P/N≥2.1即判定为阳性，计算抗体滴度。
1.4.3 ELISPOT检测特异性IFNγ分泌水平。
首免后6周，将各免疫组小鼠处死取脾脏，分离脾淋巴细胞，用含10%胎牛血清RPMI1640培养液稀释细胞浓度为2.5×106个/ml。每组小鼠的脾淋巴细胞作3个重复孔，并设置非特异性刺激物ConA为阳性对照。ELISPOT检测步骤为：用50 μl/孔70%乙醇预处理ELISPOT板；弃去液体，无菌水洗涤5次；用无菌PBS（pH 7.4）稀释包被IFNγ抗体（AN18）至15 μg/ml，每孔100 μl，4 ℃包被过夜；弃去包被液，并用无菌PBS洗板5次；加入含10%胎牛血清RPMI1640 200 μl/孔，室温孵育30 min。弃去细胞上清，加入含有2.5 μg/ml OVA T细胞表位多肽刺激物的脾淋巴细胞悬液，200 μl/孔。用锡箔纸包住板子置于37 ℃ 5% CO2培养箱，孵育48 h。48 h后弃去细胞液，PBS洗板5次；用0.5% FBSPBS稀释检测抗体（R46A2生物素）至1 μg/ml，100 μl/孔，室温作用2 h。PBS洗板5次，用0.5% FBS–PBS 1∶1 000稀释联合亲霉素ALP，100 μl/孔，室温作用1 h。PBS洗板5次，底物（BCIP/NBTplus）用0.45 μm的滤器进行过滤，100 μl/孔，室温作用直至出现斑点。用水冲洗即可终止显色反应，将板子倒置晾干，室温避光保存板子。利用ELISpot reader观察并计数斑点。
2 结果与分析
2.1 嵌合蛋白的鉴定
电镜结果表明，3种嵌合蛋白DN1、DN2和DC均可形成大小约为40 nm的VLPs，形态大小均与VP60蛋白VLPs相似（图1），说明VP60的2～13AA和302～309AA区域的改造不影响VP60 VLPs的形成。
2.2 VP60特异性抗体效价的测定
为检测嵌合VP60蛋白免疫小鼠后诱导产生的体液免疫反应，分别于首免后0、4和6周采血分离血清，采用ELISA检测各组诱导产生的特异性抗体效价滴度。从图2可以看出，嵌合蛋白组以及VP60组诱导产生的特异性抗体效价滴度与PBS对照组差异极显著（P<0.001）。DN1、DN2、DC和VP60组免疫后与免疫前抗体效价差异极显著（P<0.001），首免后6周，嵌合蛋白组与VP60组抗体效价均高于首免后4周的水平，且消长规律一致。嵌合蛋白组与VP60组之间抗体效价并无显著性差异（P>0.05）。这表明，重组蛋白免疫后能有高效地诱导机体产生抗VP60特异性抗体，且外源双串联T细胞表位的插入并未影响抗体产生的水平，嵌合蛋白有效地保持了VP60蛋白原有的免疫特性。
2.3 ELISPOT检测特异性IFNγ分泌水平
为了检测嵌合蛋白中插入的双串联OVA T细胞表位能否诱发特异性细胞免疫应答，首免后6 周分离免疫小鼠脾淋巴细胞，利用合成OVAT细胞表位多肽刺激淋巴细胞，ELISPOT检测各免疫组小鼠脾脏淋巴细胞分泌特异性IFNγ的水平。从图3可以看出，VP60组无斑点产生，而3种嵌合蛋白组均显示出一定数量的斑点，说明能够诱导特异性IFNγ的分泌，同时非特异性刺激剂ConA作为阳性对照，能够诱导产生大量的IFNγ的分泌。 将所有细胞孔中的斑点数据进行分析。从图4可以看出，3种嵌合蛋白免疫小鼠脾淋巴细胞均能够分泌特异性IFNγ，且分泌水平显著高于VP60及PBS对照组（P<0.001），其中DN1和DN2组分泌特异性IFNγ的水平显著高于DC组（P<0.05）。该结果表明在VP60 N端插入外源T细胞表位与VP60 302～309AA相比，能够诱导产生的细胞免疫应答更加强烈。
3 讨论
在昆虫细胞中表达RHDV VP60蛋白时，它能够自发地形成形态学上和抗原学上与天然病毒无差异的病毒样颗粒，其可以诱导机体产生中和抗体及有效的细胞免疫应答，不含有遗传物质，能够携带和有效递呈外源片段，可以作为疫苗载体，为新型疫苗的研制提供基础。Nagesha等[17]研究了对RHDV VP60的N端和C端进行缺失处理或用蓝舌病毒衣壳蛋白VP7上的一个特征性的6个氨基酸残基位点—Btag进行替换，结果表明在N端插入外源序列不影响嵌合蛋白形成VLPs。E.Crisci[14]等在VP60的N端和306AA中插入单个OVA CD+8 T细胞表位，结果显示可形成嵌合的RHDV样的病毒粒子，且可诱导强烈的细胞免疫应答。Khairunadwa Jemon等[22]将人通用辅助性T细胞表位PADRE插入VP60蛋白的N末端，并在形成的VLPs表面连接人乳头瘤病毒E6蛋白中一小肽，该嵌合VLPs能够对肿瘤小鼠的产生有效的免疫治疗，并延长肿瘤小鼠的存活时间，研究表明VP60 N末端是一个良好的外源T细胞表位插入位点。在以上研究报道的基础上，笔者选择N端插入或替换为双串联OVA CD+8 T细胞表位的方式构建并获得2种嵌合蛋白，且将302～309AA替换为串联OVA CD+8 T细胞表位构建并获得一种嵌合蛋白，嵌合蛋白共携带外源片段的长度为22个氨基酸，通过嵌合蛋白的纯化鉴定、动物免疫以及免疫后体液和细胞免疫应答的检测分析，结果发现嵌合蛋白仍然具有形成VLPs的能力，且能够诱导产生高水平的特异性细胞免疫应答，该试验结果与相关报道结果一致，且进一步扩展了RHDV VP60作为载体容纳外源片段的长度，验证了VLPs具有高效递呈外源T细胞表位的能力。
Xue Wang等通过低温电镜和晶体学技术解析RHDV的结构，发现VP60的300～318位氨基酸含有位于病毒粒子最外表面的Loop区[13]。该研究中选取的替换位点302～309AA包含在300～318位氨基酸中，位于P2亚单位突环处，且不包含保守氨基酸位点，故可能对外源基因的耐受性较高。该研究结果表明在VP60的N端和302～309位插入长达66 bp的外源片段后不影响VP60的自我组装。
ELISPOT技术是一种国际公认的用于检测特异性效应细胞分泌水平的方法。为检测VP60作为展示系统递呈外源OVA T细胞表位的能力，笔者在首免后6周分离脾淋巴细胞，利用ELISPOT方法进行检测。结果表明，嵌合蛋白组均能诱导分泌特异性IFNγ。该研究中VP60 N端插入外源T细胞表位的嵌合蛋白组比在VP60 302-309位插入外源表位的嵌合蛋白组引起的特异性细胞免疫应答能力更强，此结果与E.Crisci等的报道一致，进一步证实了N末端能够更加有效的递呈外源T细胞表位。
笔者利用前期构建的3种嵌合蛋白DN1、DN2和DC，进行动物免疫试验，通过体液和细胞免疫应答检测嵌合蛋白的免疫特性，结果表明3种嵌合蛋白均能引起针对载体VP60的特异性抗体应答；且能够诱导特异性IFNγ的分泌，其中DN1和DN2诱导的分泌水平高于DC组。这说明在VP60 N端插入外源T细胞表位比在VP60 302～309位插入表位引起的特异性细胞免疫应答能力更强。该研究结果扩展了VP60VLPs作为载体容纳外源片段的长度，同时进一步验证了VP60VLPs递呈外源表位的载体效应。
参考文献
[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].3版.北京：中国农业出版社，1998：299-301.
[2]王芳，胡波，范志宇，等.兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[J].畜牧兽医学报，2008，39（10）：1382-1387.
[3]LIU S J，XUE H P，PU B Q，et al.A new viral disease in rabbit[J].AnimHusb Vet Med，1984，16：253-255.
[4]XU W Y.Viral haemorrhagic disease of rabbits in the People’s Republic of China：Epidemiology and virus characterization[J].Rev Sci Tech，1991，10：393-408.
[5]PARK N Y，CHONG C Y，KIM J H，et al.An outbreak of viral haemorrhagic pneumonia （tentative name）of rabbits in Korea[J].J Korean Vet Med Assoc，1987，23：603-610.
[6]BOGA J A，MARTN ALONSO J M，Casais R，et al.A single dose immunization with Rabbit haemorrhagic disease virus major capsid protein produced in Saccharomyces cerevisiae induces protection[J].J Gen Virol，1997，78：2315-2318.
[7]LAURENT S，VAUTHEROT J F，MADELAINE M F，et al.Recombinant Rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus selfassembles into viruslike particles and induces protection[J].J Virol，1994，68（10）：6794-6798. [8]NAGESHA H S，WANG L F，HYATT A D，et al.Selfassembly，antigenicity，and immunogenicity of the Rabbit haemorrhagic disease virus（Czechoslovakian strain V351）capsid protein expressed in baculovirus[J].Arch Virol，1995，140（6）：1095-1108.
[9]SIBILIA M，BONIOTTI M B，ANGOSCINI P，et al.Two independent pathways of expression lead to selfassembly of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein[J].J Virol，1995，69（9）：5812-5815.
[10]LI Z X，HU W D，LI B C，et al.Egg yolk IgY against RHDVcapsid protein VP60 promotes rabbit defense against RHDV infection[J].Vet Immunol Immunopathol，2014，157（1/2）：97-104.
[11]GAO J，MENG C，CHEN Z，et al.Codon optimization of the rabbit hemorrhagic disease virus（RHDV）capsid gene leads to increased gene expression in Spodopterafrugiperda 9（Sf9）cells[J].J Vet Sci，2013，14（4）：441-447.
[12]YUAN D，QU L，LIU J，et al.DNA vaccination with a gene encoding VP60 elicited protective immunity against rabbit hemorrhagic disease virus[J].Vet Microbiol，2013，164（1/2）：1-8.
[13]WANG X，XU F，LIU J，et al.Atomic model of rabbit hemorrhagic disease virus by cryoelectron microscopy and crystallography[J].PLoS Pathog，2013，9（1）：1003132.
[14]CRISCI E，ALMANZA H，MENA I，et al.Chimeric caliciviruslike particles elicit protective antiviral cytotoxic responses without adjuvant[J].Virology，2009，387：303-312.
[15]LAURENT S，KUT E，REMYDELAUNAY S，et al.Folding of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein and delineation of Nterminal domains dispensable for assembly[J].Arch Virol，2002，147：1559-1571.
[16]BARCENA J，MORALES M，VAZQUEZ B，et al.Horizontal transmissible protection against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease by using a recombinant myxoma virus[J].J Virol，2000，74：1114-1123.
[17]NAGESHA H S，WANG L F，HYATT A D.Viruslike particles of calicivirus as epitope carriers[J].Arch Virol，1999，144：2429-2439.
[18]BARCENA J，VERDAGUER N，ROCA R，et al.The coat protein of Rabbit hemorrhagic disease virus contains a molecular switch at the Nterminal region facing the inner surface of the capsid[J].Virology，2004，322：118-134.
[19]张燕，王芳，胡波，等.兔出血症病毒衣壳蛋白 N 端携带双串联卵清蛋白 T 细胞表位嵌合体的构建与表达[J].畜牧与兽医，2014，46（6）：1-8.
[20]张燕，胡波，宋艳华，等.携带双串联卵清蛋白 T 细胞表位的嵌合兔出血症病毒衣壳蛋白自聚能力的研究[J].华北农学报，2014，29（1）：55-61.
[21]李超美，王芳，蔡少平，等.检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立[J].江苏农业学报，2010，26（5）：546-550.
[22]JEMON K，YOUNG V，WILSON M，et al.An enhanced heterologous viruslike particle for human papillomavirus type 16 tumour immunotherapy[J].PLoS One，2013，8（6）：66866.
关键词 RHDV；衣壳蛋白；OVA T细胞表位；嵌合蛋白；免疫原性研究
中图分类号 S858.29 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）32-089-04
Abstract Three chimeric RHDVVLPs incorporating double CD+8 Tcell epitopes derived from chicken ovalbumin （OVA） were constructed. Two integrations were performed by replacing aa.2-13 （DN2） and 302-309 （DC） of VP60 with OVA epitopes respectively， and another one was generated by inserting the epitopes into Nterminus of VP60 （DN1）. Three chimeric proteins were expressed in baculovirus system and selfassembled into VLPs correctly. Three chimeric proteins could induce high levels of antiVP60 specific antibody and specific IFNγ production in the murine model. The antiVP60 specific antibody titers of chimeric proteins groups were comparable with that in group VP60. Chimeric proteins groups showed significant higher productions of specific IFNγthan that in group VP60. Our result indicated that insertions or replacement of foreign epitopes at the specific locations of VP60 could effectively induce cellular immune responses. The manuscript should be very valuable for using RHDVVLPs as a carrier for foreign sequences.
Key words Rabbit hemorrhagic disease virus； Capsid protein （VP60）； OVA Tcell epitope； Chimeric protein； Immunogenicity
兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种具有高度传染性、高发病率、高致死性的疾病，是兔的一种毁灭性传染病[1-2]。该病在世界各地都有发生，在欧洲和东亚地区呈地方性流行[3-5]。兔出血症的病原RHDV是杯状病毒的成员之一，属于单链正股RNA病毒，基因组长约7.5 kb，其衣壳蛋白VP60可自行装配形成VLPs（Viruslike particles）[6-9]，是RHDV结构及免疫原性研究的重点[10-13]。目前，已有大量研究表明VP60 VLPs可以作为外源表位递呈载体和基因转移载体，为其发展成为携带多表位的载体疫苗提供依据[14-18]。
为进一步扩展RHDV VLPs作为载体容纳外源片段的长度以及作为载体有效递呈外源T细胞表位的能力，笔者将外源双串联CD+8T细胞表位，序列为GSSIINFEKLGSSIINFEKLGS，按照以下方式分别整合到VP60序列中：将双串联OVA CD+8 T细胞表位插入VP60 N末端；将双串联OVA CD+8 T细胞表位序列分别替换VP60蛋白的2～13AA和302～309AA，通过杆状病毒表达载体构建嵌合体，最终表达获得3种嵌合蛋白，分别命名为VP60DN1、VP60DN2和VP60DC[19-20]。在上述研究的基础上，笔者将获得嵌合蛋白进行浓缩纯化，选择特异性的C57BL/6雌性小鼠进行免疫试验，通过体液免疫应答和细胞免疫应答全面阐述VP60作为载体递呈外源表位的能力，进一步证实VP60 VLPs具有作为疫苗载体的潜在价值。
1 材料与方法
1.1 试剂、病毒和实验动物
重组杆状病毒rAcVBacVP60、rAcVBacDN1、rAcVBacDN2和rAcVBacDC由农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室构建并保存[2，19-20]。OVA CD+8 T细胞表位多肽由吉尔生化公司合成；ELISPOT试剂盒购自Mabtech公司。7～8周龄C57BL/6雌性小鼠购自扬州大学比较医学中心。 1.2 病毒样颗粒的电镜观察
将重组杆状病毒rAcVBacVP60、rAcVBacDN1、rAcVBacDN2和rAcVBacDC接种Sf9细胞，培养4～5 d待细胞完全病变后，分别收获细胞培养物，3 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用PBS重悬洗涤3次后，反复冻融3次，12 000 r/min离心5 min，取上清，用作电镜观察。将待检病毒培养物样品滴于载样铜网上，吸附作用2 min，将2%的磷钨酸染液滴于铜网上，固定2 min。室温干燥后用H7650型透射电镜对嵌合蛋白进行观察。
1.3 嵌合蛋白的制备
将4种重组杆状病毒分别以1%体积比接种于单层Sf9昆虫细胞，培养4～5 d待细胞完全病变后，分别收获细胞培养物，反复冻融3次后，5 000 g离心15 min去除细胞碎片，再次10 000 g离心30 min去除大的蛋白复合物和杆状病毒粒子，上清中的VLPs再次100 000 g离心2.5 h进行浓缩，4 ℃PBS重悬沉淀，进一步通过蔗糖密度梯度离心进行纯化，将样品铺于10%～50%蔗糖上，100 000 g 4 ℃离心2 h，吸取分界面的样品，再次超速离心100 000 g 4 ℃离心2 h除去蔗糖，沉淀用PBS重悬。利用BAC蛋白定量试剂盒测定纯化后重组蛋白的浓度，最终获得的重组蛋白分别命名为DN1、DN2、DC和VP60蛋白。
1.4 嵌合蛋白的免疫特性研究
1.4.1 动物免疫。
将嵌合蛋白DN1、DN2、DC以及VP60蛋白分别免疫7～8周龄C57BL/6雌性小鼠，每组5只，共免3次，每次间隔2周，免疫程序见表1。设置相同注射体积的PBS组作为空白对照组。于首免后0、4和6周对所有小鼠尾部采血分离血清，采用建立的间接ELISA方法[21]检测VP60特异性抗体滴度。于首免后6周将所有小鼠安乐死后分离脾淋巴细胞，用于检测特异性IFNγ分泌水平。
1.4.2 VP60特异性抗体效价的测定。
首免后0、4和6周对所有小鼠尾部采血分离血清，采用间接ELISA法检测各组小鼠血清中抗VP60的特异性抗体滴度。用pH 9.6包被液稀释VP60蛋白，4 ℃下包被过夜。脱脂乳37 ℃下封闭2 h。洗涤后每孔加入倍比稀释的待检血清，100 μl/孔，37 ℃孵育1 h。加入1∶10 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h。加入显色液100 μl/孔，避光作用10 min，最后加入终止液，50 μl /孔。自动酶标仪测定OD450值，将P/N≥2.1即判定为阳性，计算抗体滴度。
1.4.3 ELISPOT检测特异性IFNγ分泌水平。
首免后6周，将各免疫组小鼠处死取脾脏，分离脾淋巴细胞，用含10%胎牛血清RPMI1640培养液稀释细胞浓度为2.5×106个/ml。每组小鼠的脾淋巴细胞作3个重复孔，并设置非特异性刺激物ConA为阳性对照。ELISPOT检测步骤为：用50 μl/孔70%乙醇预处理ELISPOT板；弃去液体，无菌水洗涤5次；用无菌PBS（pH 7.4）稀释包被IFNγ抗体（AN18）至15 μg/ml，每孔100 μl，4 ℃包被过夜；弃去包被液，并用无菌PBS洗板5次；加入含10%胎牛血清RPMI1640 200 μl/孔，室温孵育30 min。弃去细胞上清，加入含有2.5 μg/ml OVA T细胞表位多肽刺激物的脾淋巴细胞悬液，200 μl/孔。用锡箔纸包住板子置于37 ℃ 5% CO2培养箱，孵育48 h。48 h后弃去细胞液，PBS洗板5次；用0.5% FBSPBS稀释检测抗体（R46A2生物素）至1 μg/ml，100 μl/孔，室温作用2 h。PBS洗板5次，用0.5% FBS–PBS 1∶1 000稀释联合亲霉素ALP，100 μl/孔，室温作用1 h。PBS洗板5次，底物（BCIP/NBTplus）用0.45 μm的滤器进行过滤，100 μl/孔，室温作用直至出现斑点。用水冲洗即可终止显色反应，将板子倒置晾干，室温避光保存板子。利用ELISpot reader观察并计数斑点。
2 结果与分析
2.1 嵌合蛋白的鉴定
电镜结果表明，3种嵌合蛋白DN1、DN2和DC均可形成大小约为40 nm的VLPs，形态大小均与VP60蛋白VLPs相似（图1），说明VP60的2～13AA和302～309AA区域的改造不影响VP60 VLPs的形成。
2.2 VP60特异性抗体效价的测定
为检测嵌合VP60蛋白免疫小鼠后诱导产生的体液免疫反应，分别于首免后0、4和6周采血分离血清，采用ELISA检测各组诱导产生的特异性抗体效价滴度。从图2可以看出，嵌合蛋白组以及VP60组诱导产生的特异性抗体效价滴度与PBS对照组差异极显著（P<0.001）。DN1、DN2、DC和VP60组免疫后与免疫前抗体效价差异极显著（P<0.001），首免后6周，嵌合蛋白组与VP60组抗体效价均高于首免后4周的水平，且消长规律一致。嵌合蛋白组与VP60组之间抗体效价并无显著性差异（P>0.05）。这表明，重组蛋白免疫后能有高效地诱导机体产生抗VP60特异性抗体，且外源双串联T细胞表位的插入并未影响抗体产生的水平，嵌合蛋白有效地保持了VP60蛋白原有的免疫特性。
2.3 ELISPOT检测特异性IFNγ分泌水平
为了检测嵌合蛋白中插入的双串联OVA T细胞表位能否诱发特异性细胞免疫应答，首免后6 周分离免疫小鼠脾淋巴细胞，利用合成OVAT细胞表位多肽刺激淋巴细胞，ELISPOT检测各免疫组小鼠脾脏淋巴细胞分泌特异性IFNγ的水平。从图3可以看出，VP60组无斑点产生，而3种嵌合蛋白组均显示出一定数量的斑点，说明能够诱导特异性IFNγ的分泌，同时非特异性刺激剂ConA作为阳性对照，能够诱导产生大量的IFNγ的分泌。 将所有细胞孔中的斑点数据进行分析。从图4可以看出，3种嵌合蛋白免疫小鼠脾淋巴细胞均能够分泌特异性IFNγ，且分泌水平显著高于VP60及PBS对照组（P<0.001），其中DN1和DN2组分泌特异性IFNγ的水平显著高于DC组（P<0.05）。该结果表明在VP60 N端插入外源T细胞表位与VP60 302～309AA相比，能够诱导产生的细胞免疫应答更加强烈。
3 讨论
在昆虫细胞中表达RHDV VP60蛋白时，它能够自发地形成形态学上和抗原学上与天然病毒无差异的病毒样颗粒，其可以诱导机体产生中和抗体及有效的细胞免疫应答，不含有遗传物质，能够携带和有效递呈外源片段，可以作为疫苗载体，为新型疫苗的研制提供基础。Nagesha等[17]研究了对RHDV VP60的N端和C端进行缺失处理或用蓝舌病毒衣壳蛋白VP7上的一个特征性的6个氨基酸残基位点—Btag进行替换，结果表明在N端插入外源序列不影响嵌合蛋白形成VLPs。E.Crisci[14]等在VP60的N端和306AA中插入单个OVA CD+8 T细胞表位，结果显示可形成嵌合的RHDV样的病毒粒子，且可诱导强烈的细胞免疫应答。Khairunadwa Jemon等[22]将人通用辅助性T细胞表位PADRE插入VP60蛋白的N末端，并在形成的VLPs表面连接人乳头瘤病毒E6蛋白中一小肽，该嵌合VLPs能够对肿瘤小鼠的产生有效的免疫治疗，并延长肿瘤小鼠的存活时间，研究表明VP60 N末端是一个良好的外源T细胞表位插入位点。在以上研究报道的基础上，笔者选择N端插入或替换为双串联OVA CD+8 T细胞表位的方式构建并获得2种嵌合蛋白，且将302～309AA替换为串联OVA CD+8 T细胞表位构建并获得一种嵌合蛋白，嵌合蛋白共携带外源片段的长度为22个氨基酸，通过嵌合蛋白的纯化鉴定、动物免疫以及免疫后体液和细胞免疫应答的检测分析，结果发现嵌合蛋白仍然具有形成VLPs的能力，且能够诱导产生高水平的特异性细胞免疫应答，该试验结果与相关报道结果一致，且进一步扩展了RHDV VP60作为载体容纳外源片段的长度，验证了VLPs具有高效递呈外源T细胞表位的能力。
Xue Wang等通过低温电镜和晶体学技术解析RHDV的结构，发现VP60的300～318位氨基酸含有位于病毒粒子最外表面的Loop区[13]。该研究中选取的替换位点302～309AA包含在300～318位氨基酸中，位于P2亚单位突环处，且不包含保守氨基酸位点，故可能对外源基因的耐受性较高。该研究结果表明在VP60的N端和302～309位插入长达66 bp的外源片段后不影响VP60的自我组装。
ELISPOT技术是一种国际公认的用于检测特异性效应细胞分泌水平的方法。为检测VP60作为展示系统递呈外源OVA T细胞表位的能力，笔者在首免后6周分离脾淋巴细胞，利用ELISPOT方法进行检测。结果表明，嵌合蛋白组均能诱导分泌特异性IFNγ。该研究中VP60 N端插入外源T细胞表位的嵌合蛋白组比在VP60 302-309位插入外源表位的嵌合蛋白组引起的特异性细胞免疫应答能力更强，此结果与E.Crisci等的报道一致，进一步证实了N末端能够更加有效的递呈外源T细胞表位。
笔者利用前期构建的3种嵌合蛋白DN1、DN2和DC，进行动物免疫试验，通过体液和细胞免疫应答检测嵌合蛋白的免疫特性，结果表明3种嵌合蛋白均能引起针对载体VP60的特异性抗体应答；且能够诱导特异性IFNγ的分泌，其中DN1和DN2诱导的分泌水平高于DC组。这说明在VP60 N端插入外源T细胞表位比在VP60 302～309位插入表位引起的特异性细胞免疫应答能力更强。该研究结果扩展了VP60VLPs作为载体容纳外源片段的长度，同时进一步验证了VP60VLPs递呈外源表位的载体效应。
参考文献
[1]蔡宝祥.家畜传染病学[M].3版.北京：中国农业出版社，1998：299-301.
[2]王芳，胡波，范志宇，等.兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[J].畜牧兽医学报，2008，39（10）：1382-1387.
[3]LIU S J，XUE H P，PU B Q，et al.A new viral disease in rabbit[J].AnimHusb Vet Med，1984，16：253-255.
[4]XU W Y.Viral haemorrhagic disease of rabbits in the People’s Republic of China：Epidemiology and virus characterization[J].Rev Sci Tech，1991，10：393-408.
[5]PARK N Y，CHONG C Y，KIM J H，et al.An outbreak of viral haemorrhagic pneumonia （tentative name）of rabbits in Korea[J].J Korean Vet Med Assoc，1987，23：603-610.
[6]BOGA J A，MARTN ALONSO J M，Casais R，et al.A single dose immunization with Rabbit haemorrhagic disease virus major capsid protein produced in Saccharomyces cerevisiae induces protection[J].J Gen Virol，1997，78：2315-2318.
[7]LAURENT S，VAUTHEROT J F，MADELAINE M F，et al.Recombinant Rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus selfassembles into viruslike particles and induces protection[J].J Virol，1994，68（10）：6794-6798. [8]NAGESHA H S，WANG L F，HYATT A D，et al.Selfassembly，antigenicity，and immunogenicity of the Rabbit haemorrhagic disease virus（Czechoslovakian strain V351）capsid protein expressed in baculovirus[J].Arch Virol，1995，140（6）：1095-1108.
[9]SIBILIA M，BONIOTTI M B，ANGOSCINI P，et al.Two independent pathways of expression lead to selfassembly of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein[J].J Virol，1995，69（9）：5812-5815.
[10]LI Z X，HU W D，LI B C，et al.Egg yolk IgY against RHDVcapsid protein VP60 promotes rabbit defense against RHDV infection[J].Vet Immunol Immunopathol，2014，157（1/2）：97-104.
[11]GAO J，MENG C，CHEN Z，et al.Codon optimization of the rabbit hemorrhagic disease virus（RHDV）capsid gene leads to increased gene expression in Spodopterafrugiperda 9（Sf9）cells[J].J Vet Sci，2013，14（4）：441-447.
[12]YUAN D，QU L，LIU J，et al.DNA vaccination with a gene encoding VP60 elicited protective immunity against rabbit hemorrhagic disease virus[J].Vet Microbiol，2013，164（1/2）：1-8.
[13]WANG X，XU F，LIU J，et al.Atomic model of rabbit hemorrhagic disease virus by cryoelectron microscopy and crystallography[J].PLoS Pathog，2013，9（1）：1003132.
[14]CRISCI E，ALMANZA H，MENA I，et al.Chimeric caliciviruslike particles elicit protective antiviral cytotoxic responses without adjuvant[J].Virology，2009，387：303-312.
[15]LAURENT S，KUT E，REMYDELAUNAY S，et al.Folding of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein and delineation of Nterminal domains dispensable for assembly[J].Arch Virol，2002，147：1559-1571.
[16]BARCENA J，MORALES M，VAZQUEZ B，et al.Horizontal transmissible protection against myxomatosis and rabbit hemorrhagic disease by using a recombinant myxoma virus[J].J Virol，2000，74：1114-1123.
[17]NAGESHA H S，WANG L F，HYATT A D.Viruslike particles of calicivirus as epitope carriers[J].Arch Virol，1999，144：2429-2439.
[18]BARCENA J，VERDAGUER N，ROCA R，et al.The coat protein of Rabbit hemorrhagic disease virus contains a molecular switch at the Nterminal region facing the inner surface of the capsid[J].Virology，2004，322：118-134.
[19]张燕，王芳，胡波，等.兔出血症病毒衣壳蛋白 N 端携带双串联卵清蛋白 T 细胞表位嵌合体的构建与表达[J].畜牧与兽医，2014，46（6）：1-8.
[20]张燕，胡波，宋艳华，等.携带双串联卵清蛋白 T 细胞表位的嵌合兔出血症病毒衣壳蛋白自聚能力的研究[J].华北农学报，2014，29（1）：55-61.
[21]李超美，王芳，蔡少平，等.检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立[J].江苏农业学报，2010，26（5）：546-550.
[22]JEMON K，YOUNG V，WILSON M，et al.An enhanced heterologous viruslike particle for human papillomavirus type 16 tumour immunotherapy[J].PLoS One，2013，8（6）：66866.