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摘要 [目的]研究含多种中药成分的抗菌喷雾的体外抗菌效果并对其抗菌机理进行分析。[方法]选用大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）2种菌，用肉汤稀释法和荧光染色法测定抗菌喷雾对其抑菌活性、抑菌率、最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），用滤纸片法测定其抑菌环，用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察抗菌喷雾对细菌表面结构和超微结构的影响。[结果] 中药抗菌喷雾在极短的时间内对E.coli和S.aureus的抑菌率就能达到100%，滤纸法显示抑菌环明显;MIC和MBC结果说明了中药抗菌喷雾在稀释5倍之后仍对2种细菌具有抑制作用;喷雾作用后的细菌大量死亡，表面及内部结构均发生明显变化。[结论]多种中药成分的抗菌喷雾对E.coli和S.aureus具有显著的联合抑菌效果。
关键词 中药抗菌喷雾;植物抗菌;抗菌活性;荧光染色;超微结构;抗菌机理
中图分类号 R285文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）10-0167-07
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.045
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Antibacterial Performance Test of Traditional Chinese Medicine Antibacterial Spray in Vitro
ZHANG Rui，LIN Ming-yue，WANG Chen-xin et al
（Research Center for Nano-Biomaterials，Analytical & Testing Center， Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610065）
Abstract [Objective] To study the in vitro antibacterial effect of an antibacterial spray which contains several kinds of traditional Chinese medicine and analyze its antibacterial mechanism.[Method]Escherichia coli （E.coli） and Staphylococcus aureus （S.aureus） were selected to determine the antibacterial activity， antibacterial rate， minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of antibacterial spray by broth microdilution method and fluorescence staining method. The inhibition zone was determined by filter paper method. The effects of antibacterial spray on the surface structure and ultrastructure of bacteria were observed by scanning electron microscope （SEM） and transmission electron microscope （TEM）. [Result] The antibacterial rate of traditional Chinese medicine antibacterial spray against E.coli and S.aureus could reach 100% in a very short time. Filter paper method demonstrated obvious inhibition zone. The results of MIC and MBC indicated that the traditional Chinese medicine antibacterial spray against E.coli and S.aureus still had two kinds of bacteria inhibition effect after 5 times dilution. After spraying， a large number of bacteria died， and the surface and internal structure changed evidently. [Conclusion]The antibacterial spray of various kinds of Chinese medicine has remarkable bacteriostatic effect on E.coli and S.aureus.
Key words Traditional Chinese medicine antibacterial spray;Plant antibacterial;Antibacterial activity;Fluorescent staining;Ultrastructure;Antibacterial mechanism
抗生素的發现与应用使多种由致病菌引起的细菌感染性疾病有了很好的控制和治疗效果，大大地降低了人类细菌感染引起的发病率和死亡率。但抗菌药物在发挥强大抗菌功效的同时，致病菌也不断对现有药物产生适应性，即耐药性[1]。天然中草药因具有毒性低、抗菌范围广、不易产生耐药性、价格低廉等优点而成为研究的热点。此次试验所使用的中药抗菌喷雾，其主要成分为乙醇、苯扎氯铵和多种中草药（薄荷浸提液、黄芩提取物、苦参提取物）。其中薄荷（Mentha hapiocalyx Briq.）为唇形科薄荷属多年生宿根草本植物，在我国分布范围广，是一种药食兼用作物，被广泛应用于食品及医药行业[2]。薄荷主要提取物薄荷醇是一种应用广泛的清凉剂，其具有杀菌、防腐等活性及经济实惠等优点[2]。黄芩（Scutellaria baienlensis Georgi.）为唇形科植物黄芩的根，多年生草本，其药用历史悠久[3]。黄芩活性成分主要为黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗过敏等作用，在医药和其他领域有着广泛用途[4]。苦参（Sophora flavescens Ait.）为豆科槐属植物苦参的干燥根，其提取物具有抗菌、抗炎作用等[5]。 相较中药单味药而言，多重中药的联合抗菌使其具有多向性、多层面、多靶点等特点，使菌难以同时产生对抗多种抗菌成分的多重突变，能有效达到治疗目的。中药抗菌喷雾能有效杀灭多种致病菌，主要用于鞋、袜、衣物等表面的抗菌除臭，防止菌滋生。该研究通过肉汤稀释法、荧光染色法测定抗菌喷雾抑菌活性、抑菌率、最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），用滤纸片法测定不同菌株的抑菌环并结合扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的观察分析抗菌喷雾对细菌表面结构和超微结构的影响，研究其抗菌机理，以期为天然植物抗菌剂的充分开发利用提供新思路，也为农业经济植物种植品种的选择提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂
中药抗菌喷雾（福方医疗器械有限公司研发），主要成分为乙醇、苯扎氯铵和薄荷浸提液、苦参提取物、黄芩提取物等。磷酸盐缓冲液药片（phosphate buffered saline，PBS）（赛默飞世尔科技有限公司）;胰蛋白胨、琼脂（上海阿拉丁试剂有限公司）;50%戊二醛（上海阿拉丁试剂有限公司）;无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂）;Live-Dead 试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）。
1.2 仪器
扫描电子显微镜（型号HITACH S530，日本电子株式会社）;场发射透射电子显微镜（型号G2 F20 S-TWIN，美国Tecnai公司）;荧光倒置显微镜（型号Eclipse TI-U，日本尼康（Nikon）公司）;無菌工作台（型号VS-1300-U，苏州净化设备有限公司）;立式蒸汽灭菌锅（型号LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂）;台式离心机（型号L420，长沙湘仪离心机仪器有限公司）;恒温培养箱（型号SPX-160B-2，上海福玛实验设备有限公司）;精密电子天平（型号BT-25S，德国Sartorius AG集团）。
1.3 试验方法
1.3.1 细菌培养。
试验菌株革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus，CMCC26003）、革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli，ATCC25922）均采购于上海保藏生物技术中心。将6 g 蛋白胨置于锥形瓶中，加入200 mL 蒸馏水，超声至完全溶解后，制得液体培养基，压胶塞，高压灭菌（表压0.7 kg/cm2，121 ℃，30 min），取出放凉后备用。将3 g蛋白胨和3 g琼脂置于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，超声分散均匀，压胶塞，高压灭菌后倒入培养皿，放凉后制得固体培养基备用。取少量细菌冻干粉溶于液体培养基中37 ℃培养24 h，菌液转种到固体培养基上，37 ℃恒温孵育18 h后经形态学检测后备用[6]。
1.3.2 抑菌率的测试。
用无菌接种环取较大菌落于液体培养基中37 ℃培养24 h，加灭菌生理盐水调整至3×105～4×105 CFU/mL，将菌悬液分装于5支离心管（3 mL/管），分别向管内喷洒抗菌喷雾，作用时间为0、1、2、3、4 s。作用后的液体培养基于恒温37 ℃培养18 h，浓度梯度稀释103和104倍后，将稀释后的细菌液各取100 μL 接种至固体培养基上，于37 ℃恒温培养24 h，拍照并作活菌菌落计数，按公式（1）计算抑菌率X[7]。试验均重复3次。
X=Wb-WsWb×100% （1）
式中，Wb为对照液平均菌落数（CFU/mL）;Ws为试验液平均菌落数（CFU/mL）。
1.3.3 抑菌环的测定。
将3 g蛋白胨和3 g琼脂置于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，超声分散均匀，压胶塞，高压灭菌（压力0.7 kg/cm2，温度121 ℃，时间30 min）后倒入培养皿，冷却到 50 ℃备用，将1 mL浓度为 1×108～2×108 CFU/mL的菌液加入培养皿，用冷至40～45 ℃的培养基15 mL作倾注转动平皿，使其充分均匀备用。向无菌圆形滤纸片（φ7 mm）分别喷洒抗菌喷雾，作用时间为0、1、2、3、4 s制成药敏纸片，贴于上述制备的含菌培养基表面，放于37 ℃恒温孵育24 h，观察并测量抑菌圈直径。重复试验5次，对抑菌圈直径进行统计学分析。
1.3.4 最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定。
用接种环挑取形态相似金黄色葡萄球菌S.aureus（CMCC26003）和大肠杆菌E.coli（ATCC25922）菌落3～5个，分别接种于4～5 mL的液体培养基中，pH 7.2～7.4，35 ℃孵育2～6 h。增殖后的对数生长期菌液用液体培养基校正浓度（1×108～2×108 CFU/mL）。
取96孔板，于12个孔中加入100 μL液体培养基，在第1孔加入100 μL抗菌剂原液与液体培养基混匀，然后吸取100 μL至第2孔，混匀后再吸取100 μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100 μL弃去，第11孔为不含抗菌液的生长对照。然后在每孔内加入100 μL 菌液混匀，使每孔最终菌液浓度为0.5×108～1×108 CFU/mL。置37 ℃孵箱中孵育24 h;以肉眼观察，药物最低浓度孔无细菌生长者，即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）[8]。确定MIC后，用接种环分别沾取MIC 值左右 3～5 孔的样本，接种于固体培养基上，置于 37 ℃ 恒温箱培养 18～24 h。用活菌计数法检查琼脂平板上的菌落，平均数小于5个的最小稀释浓度即为该菌的最低杀菌浓度（MBC）。试验重复3次以上。
1.3.5 Live-Dead染色。
在96孔板中的9个孔分别加入5 μL培养菌悬液（3×105～4×105 CFU/mL），以3个孔为一组，每组喷洒抗菌喷雾的时间分别为0、1、2 s，将96孔板于培养箱中培养2 h，滴入3 μL Live-Dead细菌染液（避光条件下将等量的 SYTO9染色剂和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染色剂混合）混匀后避光室温孵育15min，倒置荧光显微镜观察拍照。 1.3.6 扫描电子显微镜（SEM）观察。
将3块无菌圆形玻片放在24孔板中，在玻片中心滴100 μL菌悬液（3×105～4×105 CFU/mL），分别向玻片喷洒抗菌喷雾，时间为0、1、2 s，之后加入100 μL液体培养基，使细菌自然沉降在玻片表面于37 ℃培养2 h，用无菌 PBS 缓冲液冲洗 3 次，去除玻片表面未黏附的细菌。样本用2.5%戊二醛4 ℃ 固定2 h用梯度乙醇溶液脱水：30%、50%、75%、80%、90%各10 min，100%乙醇3次，每次10 min。乙酸异戊酯替换15 min，临界点干燥，喷金后于扫描电镜下观察，拍照。
1.3.7 透射电子显微镜（TEM）观察。
将3 mL菌液（1×108～2×108 CFU/mL）依次分装在3支1.5 mL EP管中，分别向管中喷洒抗菌喷雾时间为0、1、2 s，无菌条件下共培养2 h，离心（1 000 r/min，5 min）后弃上清液，加入0.5%戊二醛固定液重悬后，在4 ℃环境固定10 min后，高速离心（12 000 r/min，10 min）弃上清液，再加入3%戊二醛固定液固定2 h，PBS漂洗3次，锇酸固定，系列浓度丙酮加乙醇梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%，每个浓度脱水10 min），环氧树脂包埋、超薄切片、铀铅电子染色，透射电镜观察。
2 结果与分析
2.1 抑菌效果
抗菌喷雾不同作用时间对大肠杆菌（E.coli）抑菌效果与菌落数如图1和表1所示，以不同喷洒时间向装有E.coli 菌悬液（3×105～4×105 CFU/mL）的试管中喷洒抗菌喷雾，作用后的菌悬液样本经37 ℃恒温培养18 h后，稀释接种至固体培养基上37 ℃培养24 h，未喷洒抗菌剂的样本（图1a1、a2）稀释103倍后接种培养显示E.coli 成片生成，无法计数，样本稀释104倍后接种培养显示大量生长的E.coli计数为2 779 CFU;而喷洒时间为1、2、3、4 s的样本稀释103和104倍后接种到固体培养基上培养后均未见E.coli生长。
抗菌喷雾不同作用时间对金黄色葡萄球菌（S.aureus）抑菌效果与菌落数如图2和表2所示，以不同喷洒时间向装有S.aureus菌悬液（3×105～4×105 CFU/mL）的试管中喷洒抗菌喷雾，作用后的菌悬液样本经37 ℃恒温培养18 h后，稀释接种至固体培养基上37 ℃培养24 h，未喷洒抗菌剂的样本（图2a1、a2）稀释103倍后接种培养也显示成片S.aureus生成，无法计数，样本稀释104倍后接种培养显示大量生长的S.aureus计数为2 347 CFU，而喷洒时间为1、2、3、4 s的样本稀释103和104倍后接种到固体培养基上培养后均未见S.aureus生长。
2.2 抑菌环
从抗菌喷雾作用纸片不同时间后对E.coli抑菌环照片（图3a）可以看出，没有抗菌喷雾的样片周围没有抑菌环，而喷洒1～4 s的样片周围出现了明显的抑菌环，喷洒1 s的样品抑菌环直径为（9.7±0.2）mm，随着时间延长到2 s 抑菌环出现了明显的增长（P<0.05），而当时间进一步增加，各样本（2～4 s）抑菌环直径没有明显差异（图4a）。
从抗菌喷雾作用纸片不同时间后对S.aureus抑菌环照片（图3b）可以看出，没有抗菌喷雾的样片周围S.aureus没有出现抑菌环，喷洒后的样本均具有明显抑菌环;喷洒 1 s 的样品抑菌环的直径为（21.6±0.2）mm，当时间进一步增加后，作用3、4 s的抑菌环直径较1、2 s雖有所减小，但抗菌喷雾仍对S.aureus具有明显的抑菌作用（P<0.01）（图4b）。
S.aureus组的抑菌环较E.coli组宽，表明对S.aureus的抑菌效果优于E.coli。
2.3 MIC和MBC
表3是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌被稀释不同倍数的抗菌剂作用后的细菌生长情况。从MIC试验可以看出，抗菌喷雾稀释5倍后仍对2种细菌的生长具有显著的抑制作用，随着稀释倍数的增加，固体培养基表面菌落数增加，试剂的杀菌作用逐渐降低，因此，抗菌剂的大肠杆菌MIC和金黄色葡萄球菌MIC均为6倍稀释液;MBC试验表明，经过涂板计数发现大肠杆菌在试剂稀释5倍之后有少量的菌落生成，随着稀释倍数的增加，菌落数逐渐增多，得出抗菌剂的大肠杆菌MBC为5倍稀释液。金黄色葡萄球菌在试剂稀释6倍之后开始逐渐出现菌落，随后菌落数逐渐增多，抗菌剂的金黄色葡萄球菌MBC为6倍稀释液。
2.4 活死细菌荧光染色
活死细菌染液的成分为SYTO9绿色荧光核酸染色剂和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染色剂，它们光谱特征和穿透健康细菌细胞的能力都不同，可对活死细菌细胞进行染色。单独使用时，SYTO9染色剂通常会标记一个群体中的所有细菌（包括膜完整的细菌和膜受损的细菌），碘化丙啶仅穿透膜受损的细菌，当2种染料同时存在时，会导致SYTO9染色荧光减弱。当SYTO9和碘化丙啶染色剂混合使用时，细胞膜完整的细菌呈荧光绿色，而细胞膜受损的细菌呈荧光红色。这些染料的最大激发/发射波长分别为SYTO9染料的480/500 nm和碘化丙啶染料的490/635 nm，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。
在倒置荧光显微镜下同时观察，正常生长的大肠杆菌（图5a1）和金黄色葡萄球菌（图5b1）经Live/Dead荧光染色后可观察到大量绿色荧光，没有观察到明显的死亡细菌（红色荧光）;当对大肠杆菌施加1 s抗菌试剂后，可以观察到大量的死细菌，未见明显的活细菌（图5b2），随着作用时间增长到2 s后，细菌几乎全部被杀死（图5C2），无绿色荧光。在金黄色葡萄球菌试验组中，未喷抗菌试剂的样本（图5d1）可观察到大量被染成绿色的活菌，施加抗菌喷雾1 s后活菌数量减少，出现了大量被染成红色荧光的死菌（图5e2），抗菌喷雾作用时间到2 s后几乎只有红色荧光（图5f2）。 2.5 细菌表面结构变化
扫描电子显微镜（SEM）下观察喷雾作用前后细菌表面结构变化如图6所示，大肠杆菌是革兰氏阴性短杆菌，正常生长状态下大小0.5×10-3μm 细菌表面致密，有皱缩，无芽孢（图6a1），抗菌试剂作用1 s后（图6a2），大肠杆菌细胞壁出现溶解坍塌状态，菌体呈现不规则的形状，有出泡现象，随着作用时间增加到2 s（图6a3）大肠杆菌菌体皱缩、凝聚，表面结构完全破坏。抗菌喷雾作用前金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8 μm左右，显微镜下排列成葡萄串状，细胞壁光滑无芽孢（图6b1）;喷雾作用1 s后，金黄色葡萄球菌细胞壁表面粗糙并有明显凸起（图6b2），作用2 s后菌体表面出现大量不规则芽孢（图6b3）。
2.6 细菌超微结构变化
透射电子显微镜（TEM）下的细菌超微结构如图7所示。大肠杆菌具有由肽聚糖组成的细胞壁，周生鞭毛，胞内只含有核糖体等简单的细胞器，有拟核没有细胞核（图7a1）;抗菌试剂作用1 s后的大肠杆菌菌体发生变形，细胞质固缩，并且细胞质与细胞壁开始出现质壁分离，细胞壁变薄甚至缺损（图7a2）;当抗菌试剂作用2 s后，大肠杆菌细胞质固缩，染色较深，细胞壁变形，细胞膜严重破坏，大部分细胞质外漏而形成空腔（图7a3）。
金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜光滑、完整，内部的细胞质均匀，大量细菌处于分裂状态，在细菌的正常繁殖期，可见到明显的细胞中隔（图7b1）;抗菌试剂作用1 s后，金黄色葡萄球菌的细胞壁部分缺损，有内容物外泄，细胞壁结构不清晰（图7b2）;当抗菌试剂作用2 s后，大量细菌出现质壁分离，部分细菌出现空腔，同时可以看出部分分裂状态的金黄色葡萄球菌中隔细胞壁变异，失去明显的轮廓（图7b3）。
3 结论与讨论
该研究的中药抗菌喷雾试剂中苯扎氯铵含量占比在10%左右，乙醇含量占比不低于70%，其余为具有抗菌作用的中草药成分。试验结果表明，该种抗菌喷雾在极短的作用时间内就对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌效果，MIC和MBC结果显示该抗菌喷雾在较低的浓度下仍具有快速杀灭革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌的作用，通过计算可以得到其对2种细菌的抑菌率为100%，远远高于国家标准规定的抗菌率（≥70%），因此抗菌试剂具有良好的抗菌功能性[9]。
抗菌喷雾要得到快干效果，其主要成分为75%乙醇，醇类能快速将微生物浸湿穿透，乙醇分子进入蛋白质分子的肽链，使蛋白质变性沉淀，在极短的时间内快速杀死细菌。但从抗菌喷雾对金黄色葡萄球菌的3、4 s作用时间抑菌环数据可以看出，由于乙醇的挥发速度较快，无法达到长时间的抗菌效果，所以随着时间的增长，其杀菌作用受到限制。为了解决醇类杀菌作用持续时间短的问题，在抗菌喷雾中加入苯扎氯铵是利用季铵盐类消毒劑主要优点（能较长时间抑制细菌的生长繁殖）[10]与醇类进行配比，配合杀菌。其中苯扎氯铵系广谱杀菌剂，其杀菌机理是基于烷基铵阳离子在细菌细胞表面的吸附，扩散穿过细胞壁，然后结合并破坏细胞质膜。从TEM的结果可以看出抗菌喷雾作用后的细菌细胞膜发生了破坏，内部物质渗出，对膜的破坏导致钾离子和其他细胞质成分的释放最终导致细菌死亡[11]，这一现象有效验证了这一杀菌机理。同时大肠杆菌施加抗菌喷雾之后，在TEM下观察可以看出细菌发生质壁分离，内部出现了大量的空腔结构，推测是苯扎氯铵能够在水中携带正电荷的物质，与携带负电荷的细菌等微生物结合，经渗透作用直至类脂层，使得细胞膜渗透性发生变化[12];当喷雾作用时间延长，苯扎氯铵达到一定浓度，细菌便会形成胞膜非双层结构，在SEM试验结果中可见金黄色葡萄球菌的胞膜发生了变异，形成了大量的凸起，其膜结构已经破坏。最后苯扎氯铵为阳离子表面活性剂，加入抗菌喷雾后赋予喷雾清洁、去污、去角质及保湿作用[13]。
喷雾中的植物提取成分薄荷醇具有广谱抗细菌群体感应活性，强烈干扰酰基高丝氨酸内酯调节大肠杆菌等革兰氏阴性菌的致病因子和生物膜形成，同时能显著抑制金黄色葡萄球菌中α-溶血素、肠毒素A和B以及毒素休克综合征毒素1的表达，而不会干扰金黄色葡萄球菌的生长[14]，从而推测出抗菌喷雾作用2 s后，金黄色葡萄球菌的Live/Dead染色显示虽然还有少量活细菌生长，但这些活细菌毒素基因表达已受到了限制。中药抗菌喷雾中的另一植物提取成分黄芩素只引起金黄色葡萄球菌细胞膜渗透性的改变，并未破坏细胞膜的完整性，其抑菌作用靶点在胞内，进一步研究发现其能影响金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性、干扰菌体内蛋白质合成、抑制三羧酸循环和DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的活性，最终达到抑菌效果[15]，从金黄色葡萄球菌的扫描电镜可以看出细菌由于内部结构发生了变化，细胞膜表面出现了大量不规则的芽孢，从而猜测是黄芩素的作用效果。同时黄芩素抗大肠杆菌机制可能与阻断ATP合成酶有关[16]，这一机理导致了抗菌喷雾作用后的透射电镜观察下的大肠杆菌分裂过程不完整。抗菌喷雾中苦参碱能够抑制大肠杆菌体内DNA合成前期与细胞分裂相关的某些蛋白的合成[17]，使得细菌难以越过I期，进入DNA合成的R期，破坏了细菌正常的生长周期，从而抑制了细胞分裂，从大肠杆菌在抗菌喷雾作用后的透射电镜图中进一步证实了这一点，同时苦参碱还会与菌体内的蛋白结合，引起固缩、解体使其死亡，扫描电镜下也观察到了大肠杆菌施加喷雾之后菌体整体出现了溶解坍塌。在抑菌环试验中喷雾对金黄色葡萄球菌的抑菌环明显大于大肠杆菌，推测是苦参提取物乙酸乙酯具有良好的自由基清除能力，对金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌作用[18]。
添加了多种中草药成分的复方抗菌剂抗菌机理较复杂，观察抗菌喷雾作用后的细菌表面结构以及内部超微结构可以进一步证明其对2种菌的作用机理。抗菌试剂中的多种中药提取物能够溶于乙醇中，通过乙醇的渗透扩散作用，中药提取物能够穿过表面进入细胞膜，完成半渗透作用，再进一步穿入细胞内部，使细胞内酶钝化、蛋白质变性并凝集，胞内物质的渗漏，从而破坏了微生物的正常代谢，借此来杀死细菌[19]。该中药抗菌中这几类中草药都是近年发展应用较多的天然植物成分，其广谱抗菌抗炎的生物活性已经被诸多科学研究所证实[20]，但这只是天然药物研发的前期工作，起到初步定性筛选作用，在后续研究中还需对筛选出的植物资源进一步分离、纯化，鉴定其结构，分析抗菌机理，用以筛选和开发新颖、安全和环境友好的植物天然杀菌剂，从而为天然植物活性成分在农业领域的应用奠定基础[21]。 参考文献
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Antibacterial Performance Test of Traditional Chinese Medicine Antibacterial Spray in Vitro
ZHANG Rui，LIN Ming-yue，WANG Chen-xin et al
（Research Center for Nano-Biomaterials，Analytical & Testing Center， Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610065）
Abstract [Objective] To study the in vitro antibacterial effect of an antibacterial spray which contains several kinds of traditional Chinese medicine and analyze its antibacterial mechanism.[Method]Escherichia coli （E.coli） and Staphylococcus aureus （S.aureus） were selected to determine the antibacterial activity， antibacterial rate， minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of antibacterial spray by broth microdilution method and fluorescence staining method. The inhibition zone was determined by filter paper method. The effects of antibacterial spray on the surface structure and ultrastructure of bacteria were observed by scanning electron microscope （SEM） and transmission electron microscope （TEM）. [Result] The antibacterial rate of traditional Chinese medicine antibacterial spray against E.coli and S.aureus could reach 100% in a very short time. Filter paper method demonstrated obvious inhibition zone. The results of MIC and MBC indicated that the traditional Chinese medicine antibacterial spray against E.coli and S.aureus still had two kinds of bacteria inhibition effect after 5 times dilution. After spraying， a large number of bacteria died， and the surface and internal structure changed evidently. [Conclusion]The antibacterial spray of various kinds of Chinese medicine has remarkable bacteriostatic effect on E.coli and S.aureus.
Key words Traditional Chinese medicine antibacterial spray;Plant antibacterial;Antibacterial activity;Fluorescent staining;Ultrastructure;Antibacterial mechanism
抗生素的發现与应用使多种由致病菌引起的细菌感染性疾病有了很好的控制和治疗效果，大大地降低了人类细菌感染引起的发病率和死亡率。但抗菌药物在发挥强大抗菌功效的同时，致病菌也不断对现有药物产生适应性，即耐药性[1]。天然中草药因具有毒性低、抗菌范围广、不易产生耐药性、价格低廉等优点而成为研究的热点。此次试验所使用的中药抗菌喷雾，其主要成分为乙醇、苯扎氯铵和多种中草药（薄荷浸提液、黄芩提取物、苦参提取物）。其中薄荷（Mentha hapiocalyx Briq.）为唇形科薄荷属多年生宿根草本植物，在我国分布范围广，是一种药食兼用作物，被广泛应用于食品及医药行业[2]。薄荷主要提取物薄荷醇是一种应用广泛的清凉剂，其具有杀菌、防腐等活性及经济实惠等优点[2]。黄芩（Scutellaria baienlensis Georgi.）为唇形科植物黄芩的根，多年生草本，其药用历史悠久[3]。黄芩活性成分主要为黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗过敏等作用，在医药和其他领域有着广泛用途[4]。苦参（Sophora flavescens Ait.）为豆科槐属植物苦参的干燥根，其提取物具有抗菌、抗炎作用等[5]。 相较中药单味药而言，多重中药的联合抗菌使其具有多向性、多层面、多靶点等特点，使菌难以同时产生对抗多种抗菌成分的多重突变，能有效达到治疗目的。中药抗菌喷雾能有效杀灭多种致病菌，主要用于鞋、袜、衣物等表面的抗菌除臭，防止菌滋生。该研究通过肉汤稀释法、荧光染色法测定抗菌喷雾抑菌活性、抑菌率、最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），用滤纸片法测定不同菌株的抑菌环并结合扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的观察分析抗菌喷雾对细菌表面结构和超微结构的影响，研究其抗菌机理，以期为天然植物抗菌剂的充分开发利用提供新思路，也为农业经济植物种植品种的选择提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂
中药抗菌喷雾（福方医疗器械有限公司研发），主要成分为乙醇、苯扎氯铵和薄荷浸提液、苦参提取物、黄芩提取物等。磷酸盐缓冲液药片（phosphate buffered saline，PBS）（赛默飞世尔科技有限公司）;胰蛋白胨、琼脂（上海阿拉丁试剂有限公司）;50%戊二醛（上海阿拉丁试剂有限公司）;无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂）;Live-Dead 试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）。
1.2 仪器
扫描电子显微镜（型号HITACH S530，日本电子株式会社）;场发射透射电子显微镜（型号G2 F20 S-TWIN，美国Tecnai公司）;荧光倒置显微镜（型号Eclipse TI-U，日本尼康（Nikon）公司）;無菌工作台（型号VS-1300-U，苏州净化设备有限公司）;立式蒸汽灭菌锅（型号LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂）;台式离心机（型号L420，长沙湘仪离心机仪器有限公司）;恒温培养箱（型号SPX-160B-2，上海福玛实验设备有限公司）;精密电子天平（型号BT-25S，德国Sartorius AG集团）。
1.3 试验方法
1.3.1 细菌培养。
试验菌株革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus，CMCC26003）、革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli，ATCC25922）均采购于上海保藏生物技术中心。将6 g 蛋白胨置于锥形瓶中，加入200 mL 蒸馏水，超声至完全溶解后，制得液体培养基，压胶塞，高压灭菌（表压0.7 kg/cm2，121 ℃，30 min），取出放凉后备用。将3 g蛋白胨和3 g琼脂置于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，超声分散均匀，压胶塞，高压灭菌后倒入培养皿，放凉后制得固体培养基备用。取少量细菌冻干粉溶于液体培养基中37 ℃培养24 h，菌液转种到固体培养基上，37 ℃恒温孵育18 h后经形态学检测后备用[6]。
1.3.2 抑菌率的测试。
用无菌接种环取较大菌落于液体培养基中37 ℃培养24 h，加灭菌生理盐水调整至3×105～4×105 CFU/mL，将菌悬液分装于5支离心管（3 mL/管），分别向管内喷洒抗菌喷雾，作用时间为0、1、2、3、4 s。作用后的液体培养基于恒温37 ℃培养18 h，浓度梯度稀释103和104倍后，将稀释后的细菌液各取100 μL 接种至固体培养基上，于37 ℃恒温培养24 h，拍照并作活菌菌落计数，按公式（1）计算抑菌率X[7]。试验均重复3次。
X=Wb-WsWb×100% （1）
式中，Wb为对照液平均菌落数（CFU/mL）;Ws为试验液平均菌落数（CFU/mL）。
1.3.3 抑菌环的测定。
将3 g蛋白胨和3 g琼脂置于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，超声分散均匀，压胶塞，高压灭菌（压力0.7 kg/cm2，温度121 ℃，时间30 min）后倒入培养皿，冷却到 50 ℃备用，将1 mL浓度为 1×108～2×108 CFU/mL的菌液加入培养皿，用冷至40～45 ℃的培养基15 mL作倾注转动平皿，使其充分均匀备用。向无菌圆形滤纸片（φ7 mm）分别喷洒抗菌喷雾，作用时间为0、1、2、3、4 s制成药敏纸片，贴于上述制备的含菌培养基表面，放于37 ℃恒温孵育24 h，观察并测量抑菌圈直径。重复试验5次，对抑菌圈直径进行统计学分析。
1.3.4 最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定。
用接种环挑取形态相似金黄色葡萄球菌S.aureus（CMCC26003）和大肠杆菌E.coli（ATCC25922）菌落3～5个，分别接种于4～5 mL的液体培养基中，pH 7.2～7.4，35 ℃孵育2～6 h。增殖后的对数生长期菌液用液体培养基校正浓度（1×108～2×108 CFU/mL）。
取96孔板，于12个孔中加入100 μL液体培养基，在第1孔加入100 μL抗菌剂原液与液体培养基混匀，然后吸取100 μL至第2孔，混匀后再吸取100 μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100 μL弃去，第11孔为不含抗菌液的生长对照。然后在每孔内加入100 μL 菌液混匀，使每孔最终菌液浓度为0.5×108～1×108 CFU/mL。置37 ℃孵箱中孵育24 h;以肉眼观察，药物最低浓度孔无细菌生长者，即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）[8]。确定MIC后，用接种环分别沾取MIC 值左右 3～5 孔的样本，接种于固体培养基上，置于 37 ℃ 恒温箱培养 18～24 h。用活菌计数法检查琼脂平板上的菌落，平均数小于5个的最小稀释浓度即为该菌的最低杀菌浓度（MBC）。试验重复3次以上。
1.3.5 Live-Dead染色。
在96孔板中的9个孔分别加入5 μL培养菌悬液（3×105～4×105 CFU/mL），以3个孔为一组，每组喷洒抗菌喷雾的时间分别为0、1、2 s，将96孔板于培养箱中培养2 h，滴入3 μL Live-Dead细菌染液（避光条件下将等量的 SYTO9染色剂和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染色剂混合）混匀后避光室温孵育15min，倒置荧光显微镜观察拍照。 1.3.6 扫描电子显微镜（SEM）观察。
将3块无菌圆形玻片放在24孔板中，在玻片中心滴100 μL菌悬液（3×105～4×105 CFU/mL），分别向玻片喷洒抗菌喷雾，时间为0、1、2 s，之后加入100 μL液体培养基，使细菌自然沉降在玻片表面于37 ℃培养2 h，用无菌 PBS 缓冲液冲洗 3 次，去除玻片表面未黏附的细菌。样本用2.5%戊二醛4 ℃ 固定2 h用梯度乙醇溶液脱水：30%、50%、75%、80%、90%各10 min，100%乙醇3次，每次10 min。乙酸异戊酯替换15 min，临界点干燥，喷金后于扫描电镜下观察，拍照。
1.3.7 透射电子显微镜（TEM）观察。
将3 mL菌液（1×108～2×108 CFU/mL）依次分装在3支1.5 mL EP管中，分别向管中喷洒抗菌喷雾时间为0、1、2 s，无菌条件下共培养2 h，离心（1 000 r/min，5 min）后弃上清液，加入0.5%戊二醛固定液重悬后，在4 ℃环境固定10 min后，高速离心（12 000 r/min，10 min）弃上清液，再加入3%戊二醛固定液固定2 h，PBS漂洗3次，锇酸固定，系列浓度丙酮加乙醇梯度脱水（50%、70%、80%、90%、100%，每个浓度脱水10 min），环氧树脂包埋、超薄切片、铀铅电子染色，透射电镜观察。
2 结果与分析
2.1 抑菌效果
抗菌喷雾不同作用时间对大肠杆菌（E.coli）抑菌效果与菌落数如图1和表1所示，以不同喷洒时间向装有E.coli 菌悬液（3×105～4×105 CFU/mL）的试管中喷洒抗菌喷雾，作用后的菌悬液样本经37 ℃恒温培养18 h后，稀释接种至固体培养基上37 ℃培养24 h，未喷洒抗菌剂的样本（图1a1、a2）稀释103倍后接种培养显示E.coli 成片生成，无法计数，样本稀释104倍后接种培养显示大量生长的E.coli计数为2 779 CFU;而喷洒时间为1、2、3、4 s的样本稀释103和104倍后接种到固体培养基上培养后均未见E.coli生长。
抗菌喷雾不同作用时间对金黄色葡萄球菌（S.aureus）抑菌效果与菌落数如图2和表2所示，以不同喷洒时间向装有S.aureus菌悬液（3×105～4×105 CFU/mL）的试管中喷洒抗菌喷雾，作用后的菌悬液样本经37 ℃恒温培养18 h后，稀释接种至固体培养基上37 ℃培养24 h，未喷洒抗菌剂的样本（图2a1、a2）稀释103倍后接种培养也显示成片S.aureus生成，无法计数，样本稀释104倍后接种培养显示大量生长的S.aureus计数为2 347 CFU，而喷洒时间为1、2、3、4 s的样本稀释103和104倍后接种到固体培养基上培养后均未见S.aureus生长。
2.2 抑菌环
从抗菌喷雾作用纸片不同时间后对E.coli抑菌环照片（图3a）可以看出，没有抗菌喷雾的样片周围没有抑菌环，而喷洒1～4 s的样片周围出现了明显的抑菌环，喷洒1 s的样品抑菌环直径为（9.7±0.2）mm，随着时间延长到2 s 抑菌环出现了明显的增长（P<0.05），而当时间进一步增加，各样本（2～4 s）抑菌环直径没有明显差异（图4a）。
从抗菌喷雾作用纸片不同时间后对S.aureus抑菌环照片（图3b）可以看出，没有抗菌喷雾的样片周围S.aureus没有出现抑菌环，喷洒后的样本均具有明显抑菌环;喷洒 1 s 的样品抑菌环的直径为（21.6±0.2）mm，当时间进一步增加后，作用3、4 s的抑菌环直径较1、2 s雖有所减小，但抗菌喷雾仍对S.aureus具有明显的抑菌作用（P<0.01）（图4b）。
S.aureus组的抑菌环较E.coli组宽，表明对S.aureus的抑菌效果优于E.coli。
2.3 MIC和MBC
表3是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌被稀释不同倍数的抗菌剂作用后的细菌生长情况。从MIC试验可以看出，抗菌喷雾稀释5倍后仍对2种细菌的生长具有显著的抑制作用，随着稀释倍数的增加，固体培养基表面菌落数增加，试剂的杀菌作用逐渐降低，因此，抗菌剂的大肠杆菌MIC和金黄色葡萄球菌MIC均为6倍稀释液;MBC试验表明，经过涂板计数发现大肠杆菌在试剂稀释5倍之后有少量的菌落生成，随着稀释倍数的增加，菌落数逐渐增多，得出抗菌剂的大肠杆菌MBC为5倍稀释液。金黄色葡萄球菌在试剂稀释6倍之后开始逐渐出现菌落，随后菌落数逐渐增多，抗菌剂的金黄色葡萄球菌MBC为6倍稀释液。
2.4 活死细菌荧光染色
活死细菌染液的成分为SYTO9绿色荧光核酸染色剂和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染色剂，它们光谱特征和穿透健康细菌细胞的能力都不同，可对活死细菌细胞进行染色。单独使用时，SYTO9染色剂通常会标记一个群体中的所有细菌（包括膜完整的细菌和膜受损的细菌），碘化丙啶仅穿透膜受损的细菌，当2种染料同时存在时，会导致SYTO9染色荧光减弱。当SYTO9和碘化丙啶染色剂混合使用时，细胞膜完整的细菌呈荧光绿色，而细胞膜受损的细菌呈荧光红色。这些染料的最大激发/发射波长分别为SYTO9染料的480/500 nm和碘化丙啶染料的490/635 nm，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。
在倒置荧光显微镜下同时观察，正常生长的大肠杆菌（图5a1）和金黄色葡萄球菌（图5b1）经Live/Dead荧光染色后可观察到大量绿色荧光，没有观察到明显的死亡细菌（红色荧光）;当对大肠杆菌施加1 s抗菌试剂后，可以观察到大量的死细菌，未见明显的活细菌（图5b2），随着作用时间增长到2 s后，细菌几乎全部被杀死（图5C2），无绿色荧光。在金黄色葡萄球菌试验组中，未喷抗菌试剂的样本（图5d1）可观察到大量被染成绿色的活菌，施加抗菌喷雾1 s后活菌数量减少，出现了大量被染成红色荧光的死菌（图5e2），抗菌喷雾作用时间到2 s后几乎只有红色荧光（图5f2）。 2.5 细菌表面结构变化
扫描电子显微镜（SEM）下观察喷雾作用前后细菌表面结构变化如图6所示，大肠杆菌是革兰氏阴性短杆菌，正常生长状态下大小0.5×10-3μm 细菌表面致密，有皱缩，无芽孢（图6a1），抗菌试剂作用1 s后（图6a2），大肠杆菌细胞壁出现溶解坍塌状态，菌体呈现不规则的形状，有出泡现象，随着作用时间增加到2 s（图6a3）大肠杆菌菌体皱缩、凝聚，表面结构完全破坏。抗菌喷雾作用前金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8 μm左右，显微镜下排列成葡萄串状，细胞壁光滑无芽孢（图6b1）;喷雾作用1 s后，金黄色葡萄球菌细胞壁表面粗糙并有明显凸起（图6b2），作用2 s后菌体表面出现大量不规则芽孢（图6b3）。
2.6 细菌超微结构变化
透射电子显微镜（TEM）下的细菌超微结构如图7所示。大肠杆菌具有由肽聚糖组成的细胞壁，周生鞭毛，胞内只含有核糖体等简单的细胞器，有拟核没有细胞核（图7a1）;抗菌试剂作用1 s后的大肠杆菌菌体发生变形，细胞质固缩，并且细胞质与细胞壁开始出现质壁分离，细胞壁变薄甚至缺损（图7a2）;当抗菌试剂作用2 s后，大肠杆菌细胞质固缩，染色较深，细胞壁变形，细胞膜严重破坏，大部分细胞质外漏而形成空腔（图7a3）。
金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜光滑、完整，内部的细胞质均匀，大量细菌处于分裂状态，在细菌的正常繁殖期，可见到明显的细胞中隔（图7b1）;抗菌试剂作用1 s后，金黄色葡萄球菌的细胞壁部分缺损，有内容物外泄，细胞壁结构不清晰（图7b2）;当抗菌试剂作用2 s后，大量细菌出现质壁分离，部分细菌出现空腔，同时可以看出部分分裂状态的金黄色葡萄球菌中隔细胞壁变异，失去明显的轮廓（图7b3）。
3 结论与讨论
该研究的中药抗菌喷雾试剂中苯扎氯铵含量占比在10%左右，乙醇含量占比不低于70%，其余为具有抗菌作用的中草药成分。试验结果表明，该种抗菌喷雾在极短的作用时间内就对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌效果，MIC和MBC结果显示该抗菌喷雾在较低的浓度下仍具有快速杀灭革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌的作用，通过计算可以得到其对2种细菌的抑菌率为100%，远远高于国家标准规定的抗菌率（≥70%），因此抗菌试剂具有良好的抗菌功能性[9]。
抗菌喷雾要得到快干效果，其主要成分为75%乙醇，醇类能快速将微生物浸湿穿透，乙醇分子进入蛋白质分子的肽链，使蛋白质变性沉淀，在极短的时间内快速杀死细菌。但从抗菌喷雾对金黄色葡萄球菌的3、4 s作用时间抑菌环数据可以看出，由于乙醇的挥发速度较快，无法达到长时间的抗菌效果，所以随着时间的增长，其杀菌作用受到限制。为了解决醇类杀菌作用持续时间短的问题，在抗菌喷雾中加入苯扎氯铵是利用季铵盐类消毒劑主要优点（能较长时间抑制细菌的生长繁殖）[10]与醇类进行配比，配合杀菌。其中苯扎氯铵系广谱杀菌剂，其杀菌机理是基于烷基铵阳离子在细菌细胞表面的吸附，扩散穿过细胞壁，然后结合并破坏细胞质膜。从TEM的结果可以看出抗菌喷雾作用后的细菌细胞膜发生了破坏，内部物质渗出，对膜的破坏导致钾离子和其他细胞质成分的释放最终导致细菌死亡[11]，这一现象有效验证了这一杀菌机理。同时大肠杆菌施加抗菌喷雾之后，在TEM下观察可以看出细菌发生质壁分离，内部出现了大量的空腔结构，推测是苯扎氯铵能够在水中携带正电荷的物质，与携带负电荷的细菌等微生物结合，经渗透作用直至类脂层，使得细胞膜渗透性发生变化[12];当喷雾作用时间延长，苯扎氯铵达到一定浓度，细菌便会形成胞膜非双层结构，在SEM试验结果中可见金黄色葡萄球菌的胞膜发生了变异，形成了大量的凸起，其膜结构已经破坏。最后苯扎氯铵为阳离子表面活性剂，加入抗菌喷雾后赋予喷雾清洁、去污、去角质及保湿作用[13]。
喷雾中的植物提取成分薄荷醇具有广谱抗细菌群体感应活性，强烈干扰酰基高丝氨酸内酯调节大肠杆菌等革兰氏阴性菌的致病因子和生物膜形成，同时能显著抑制金黄色葡萄球菌中α-溶血素、肠毒素A和B以及毒素休克综合征毒素1的表达，而不会干扰金黄色葡萄球菌的生长[14]，从而推测出抗菌喷雾作用2 s后，金黄色葡萄球菌的Live/Dead染色显示虽然还有少量活细菌生长，但这些活细菌毒素基因表达已受到了限制。中药抗菌喷雾中的另一植物提取成分黄芩素只引起金黄色葡萄球菌细胞膜渗透性的改变，并未破坏细胞膜的完整性，其抑菌作用靶点在胞内，进一步研究发现其能影响金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性、干扰菌体内蛋白质合成、抑制三羧酸循环和DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的活性，最终达到抑菌效果[15]，从金黄色葡萄球菌的扫描电镜可以看出细菌由于内部结构发生了变化，细胞膜表面出现了大量不规则的芽孢，从而猜测是黄芩素的作用效果。同时黄芩素抗大肠杆菌机制可能与阻断ATP合成酶有关[16]，这一机理导致了抗菌喷雾作用后的透射电镜观察下的大肠杆菌分裂过程不完整。抗菌喷雾中苦参碱能够抑制大肠杆菌体内DNA合成前期与细胞分裂相关的某些蛋白的合成[17]，使得细菌难以越过I期，进入DNA合成的R期，破坏了细菌正常的生长周期，从而抑制了细胞分裂，从大肠杆菌在抗菌喷雾作用后的透射电镜图中进一步证实了这一点，同时苦参碱还会与菌体内的蛋白结合，引起固缩、解体使其死亡，扫描电镜下也观察到了大肠杆菌施加喷雾之后菌体整体出现了溶解坍塌。在抑菌环试验中喷雾对金黄色葡萄球菌的抑菌环明显大于大肠杆菌，推测是苦参提取物乙酸乙酯具有良好的自由基清除能力，对金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌作用[18]。
添加了多种中草药成分的复方抗菌剂抗菌机理较复杂，观察抗菌喷雾作用后的细菌表面结构以及内部超微结构可以进一步证明其对2种菌的作用机理。抗菌试剂中的多种中药提取物能够溶于乙醇中，通过乙醇的渗透扩散作用，中药提取物能够穿过表面进入细胞膜，完成半渗透作用，再进一步穿入细胞内部，使细胞内酶钝化、蛋白质变性并凝集，胞内物质的渗漏，从而破坏了微生物的正常代谢，借此来杀死细菌[19]。该中药抗菌中这几类中草药都是近年发展应用较多的天然植物成分，其广谱抗菌抗炎的生物活性已经被诸多科学研究所证实[20]，但这只是天然药物研发的前期工作，起到初步定性筛选作用，在后续研究中还需对筛选出的植物资源进一步分离、纯化，鉴定其结构，分析抗菌机理，用以筛选和开发新颖、安全和环境友好的植物天然杀菌剂，从而为天然植物活性成分在农业领域的应用奠定基础[21]。 参考文献
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