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摘要：目的： 研究高良姜提取物对肝癌HepG2细胞、人胰腺癌Capam-2细胞及人宫颈癌Hela细胞株的增殖抑制作用。方法：采用 MTT法检测不同剂量的高良姜氯仿提取物、正丁醇提取物及水提取物对三种肿瘤细胞增殖的影响，比较三种提取物对三种肿瘤细胞的抑制效果并计算半数抑制浓度。结果：高良姜不同提取物可呈不同程度地剂量依赖性抑制HepG2、Capam-2和Hela细胞株增殖，其中高良姜氯仿提取物抑制各肿瘤细胞的IC50明显低于高良姜正丁醇提取物和水提取物，说明氯仿提取物相比其余两种提取物抗的肿瘤活性高。结论：高良姜不同提取物能抑制多种肿瘤细胞的增殖，其氯仿提取物抗肿瘤作用更为明显。
关键词：高良姜；提取物；抗肿瘤
高良姜，别名小良姜，为姜科植物，是一种热带多年生长的山姜属食药兼用的植物，在我国古代的诸多药典如《本草纲目》和《图经本草》均有记载。高良姜主产于广东、广西、云南、海南等省，广东湛江徐聞县是我国高良姜最集中的产区，产量占全国90%以上，素有"高良姜之乡"之美称[1]。高良姜主要含黄酮类化合物、二苯基庚烷类、挥发油，还含有糖苷、苯丙素、甾醇类、微量元素等，目前仍不断分离鉴定其更多化合物[2]。高良姜化学成分复杂，药理活性强，有较强的抗氧化、降血糖、抗溃疡、止呕抗腹泻、镇痛、抗炎、抗凝血、抗血栓形成、抗菌、抗肿瘤、促进免疫调节及促进渗透性等药理作用[3，4]。本文实验研究了高良姜不同提取物体外抗肿瘤细胞株增殖的影响，旨在为其临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
高良姜不同提取物（水提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物）为广东医学院化学教研室提供；RPMI1640、胰酶（美国GIBCO公司），超级无支原体FBS（杭州四季青生物材料有限公司），四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Sigma公司），其余试剂均为国产分析纯；人肝癌HepG2细胞、人胰腺癌capam-2细胞及人宫颈癌Hela细胞（保存于广东医学院附属医院血液疾病研究室）。
1.2细胞培养
人肝癌HepG2细胞、人胰腺癌capam-2细胞及人宫颈癌Hela细胞三种人源肿瘤细胞株均用含10% 胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液，于37℃、5% CO2饱和湿度的二氧化碳孵箱中连续培养传代，实验时取对数生长期细胞。
1.3 MTT法检测高良姜提取物对三种癌细胞株增殖能力的影响
取对数生长期的不同肿瘤细胞株，接种4000/孔细胞悬液于96孔板中，37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁后，吸出培养液，加入含不同浓度的高良姜挥发油药液（100、200、400、600、800μg/mL）处理，同时设置DMSO溶剂对照组，每一浓度设4个平行孔。继续培养24 h后，每孔加入MTT （5 g/L） 20 μL，继续孵育4 h后每孔加入DMSO 150 μL。在微型振荡器上避光振荡20 min，结晶完全溶解后，立即用酶标仪在波长为570 nm检测OD值，以空白孔调零。实验每组重复3次。根据公式计算细胞增殖率：细胞增殖率（%） =加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100%，并计算其半数抑制浓度（ IC50 ）。
1.4 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件包One-Way ANOVA进行统计学处理 。实验数据以mean±SD表示，P<0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 高良姜水提取物对三种人肿瘤细胞株的增殖的抑制作用
结果显示高良姜水提取物可呈剂量依赖性抑制不同肿瘤细胞的增殖，其中对Hela细胞株比HepG2、Capam-2的抑制效果更明显，见图1。
图1 高良姜水提取物对三种肿瘤细胞增殖的影响
2.2 高良姜正丁醇提取物对三种人肿瘤细胞株的增殖的抑制作用
结果显示高良姜水提取物可呈剂量依赖性抑制不同肿瘤细胞的增殖，其中对Hela细胞株比HepG2、Capam-2的抑制效果更明显，见图2。
图2 高良姜正丁醇提取物对三种肿瘤细胞增殖的影响
2.3 高良姜氯仿提取物对三种人肿瘤细胞株的增殖的抑制作用
结果显示高良姜水提取物可呈剂量依赖性抑制不同肿瘤细胞的增殖，其中对HepG2细胞株比Hela、Capam-2的抑制效果更明显，见图3。
图3 高良姜氯仿提取物对对三种肿瘤细胞增殖的影响
2.4 高良姜不同提取物对三种肿瘤细胞的IC50比较
结果显示高良姜氯仿提取物抑制不同肿瘤细胞的IC50明显低于高良姜正丁醇提取物和水提取物，可见其比这两种提取物抗肿瘤活性高，可说明高良姜抗肿瘤活性成分存在于氯仿提取物中，主要为非极性物质。
图4 不同高良姜提取物对三种肿瘤细胞IC50的影响
3.讨论
中药资源丰富，从中药中寻找抗癌活性成分是很好的药物前体或新药开发途径[5]。高良姜作为中药材原料丰富，价格相对便宜，可食药兼用，毒副作用小。在医学上有帮助消化、健胃及治疗冻疮、灼伤、驱蚊杀菌等用途，高良姜除药用外还大量用作调味料，是多种食品的重要原料，还可用于制造保健饮料和日常护理品。目前高良姜中黄酮类化合物抗肿瘤作用研究逐渐备受关注。Lu等[6]的研究表明，高良姜总黄酮和高良姜素能明显抑制B16大鼠黑色素瘤细胞中黑色素的合成，防止皮肤癌发生。Moon等[7]研究显示高良姜素能有效降低甲基亚硝基脲对小鼠肺细胞染色体的致畸作用，并且其提取物能抑制7，12-二甲基苯并蒽引起的小鼠细胞畸变作用。而对于促癌物质TPA诱发的小鼠耳部水肿，高良姜的甲醇提取物表现出明显抑制作用[8]。高良姜提取物能有效增加人结肠癌CaCo-2细胞渗透性并降低上皮细胞的电阻[9]。常徽等[10]发现高良姜药材中的槲皮素等成分能对HL-60细胞株的增殖有抑制作用。最近研究显示，高良姜素抑制人肺癌A549细胞生长[11]，抑制缺氧诱导肺癌NCI-H157细胞合成血管生长因子。我们课题组研究发现高良姜挥发油能抑制多种实体瘤癌细胞的增殖[12]，高良姜素抑制多种肝癌细胞生长，可能通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡[13] 。本实验研究结果显示高良姜水提取物、正丁醇提取物和氯仿提取物能呈剂量依赖性抑制不同肿瘤细胞的增殖，且其抗肿瘤活性与提取溶剂的极性成反比，即提取溶剂的极性越小其提取出的物质成分的抗肿瘤活性更强，说明有效抗肿瘤成分主要是非极性成分。研究开发道地南药高良姜抗肿瘤有效成分，将扩大高良姜的应用范围增加其附加值，将具有良好的市场前景和提高当地的经济效益，应需加以开发深入研究。 参考文献：
1.朱家； 何伟； 马建春， 高良姜的研究进展. 食品与药品 2009， 11 （9）， 68.
2.罗辉； 蔡春， 高良姜化学成分研究. 中药材 1998， 21 （7）， 349-351.
3.吕玮； 蒋伶活， 高良姜的化学成分及药理作用. 中国药业 2006， 15 （3）， 19-21.
4.黄慧珍； 杨丹， 高良姜的化学成分及其药理活性研究进展. 广东化工 2009， 36 （1）， 77-80.
5.张珂； 马胜林， 天然药物抗肿瘤机制的研究进展. 中华中医药杂志 2011， 26 （10）， 2344-2347.
6.Lu， Y.-h.； Lin-Tao； Wang， Z.-t.； Wei， D.-z.； Xiang， H.-b.， Mechanism and inhibitory effect of galangin and its flavonoid mixture from Alpinia officinarum on mushroom tyrosinase and B16 murine melanoma cells. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2007， 22 （4）， 433-438.
7.Heo， M. Y.； Sohn， S. J.； Au， W. W.， Anti-genotoxicity of galangin as a cancer chemopreventive agent candidate. Mutation Research/Reviews in Mutation Research 2001， 488 （2）， 135-150.
8.安川宪， 高良姜的抗促癌作用. 国外医学： 中医中药分册 2003， 25 （1）， 53-53.
9.Konishi， Y.， Modulations of food-derived substances on intestinal permeability in Caco-2 cell monolayers. Bioscience， biotechnology， and biochemistry 2003， 67 （10）， 2297-2299.
10.常徽； 糜漫天； 顾艳艳； 袁家林； 凌文华； 林辉， 植物黄酮抗人白血病 HL-60 细胞增殖的结构-效应关系. 癌症 2007， 26 （12）， 1309-1314.
11.Ludwiczuk， A.； Saha， A.； Kuzuhara， T.； Asakawa， Y.， Bioactivity guided isolation of anticancer constituents from leaves of Alnus sieboldiana （Betulaceae）. Phytomedicine 2011， 18 （6）， 491-498.
12. 李寧； 熊勇； 张海涛； 贾振斌； 罗辉， 高良姜挥发油对不同肿瘤细胞株增殖的影响. 山东医药 2012， 52 （11）， 19-21.
13. Zhang， H.-T.； Wu， J.； Wen， M.； Su， L.-J.； Luo， H.， Galangin induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells through the caspase 8/t-Bid mitochondrial pathway. Journal of Asian natural products research 2012， 14 （7）， 626-633.
关键词：高良姜；提取物；抗肿瘤
高良姜，别名小良姜，为姜科植物，是一种热带多年生长的山姜属食药兼用的植物，在我国古代的诸多药典如《本草纲目》和《图经本草》均有记载。高良姜主产于广东、广西、云南、海南等省，广东湛江徐聞县是我国高良姜最集中的产区，产量占全国90%以上，素有"高良姜之乡"之美称[1]。高良姜主要含黄酮类化合物、二苯基庚烷类、挥发油，还含有糖苷、苯丙素、甾醇类、微量元素等，目前仍不断分离鉴定其更多化合物[2]。高良姜化学成分复杂，药理活性强，有较强的抗氧化、降血糖、抗溃疡、止呕抗腹泻、镇痛、抗炎、抗凝血、抗血栓形成、抗菌、抗肿瘤、促进免疫调节及促进渗透性等药理作用[3，4]。本文实验研究了高良姜不同提取物体外抗肿瘤细胞株增殖的影响，旨在为其临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
高良姜不同提取物（水提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物）为广东医学院化学教研室提供；RPMI1640、胰酶（美国GIBCO公司），超级无支原体FBS（杭州四季青生物材料有限公司），四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Sigma公司），其余试剂均为国产分析纯；人肝癌HepG2细胞、人胰腺癌capam-2细胞及人宫颈癌Hela细胞（保存于广东医学院附属医院血液疾病研究室）。
1.2细胞培养
人肝癌HepG2细胞、人胰腺癌capam-2细胞及人宫颈癌Hela细胞三种人源肿瘤细胞株均用含10% 胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液，于37℃、5% CO2饱和湿度的二氧化碳孵箱中连续培养传代，实验时取对数生长期细胞。
1.3 MTT法检测高良姜提取物对三种癌细胞株增殖能力的影响
取对数生长期的不同肿瘤细胞株，接种4000/孔细胞悬液于96孔板中，37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁后，吸出培养液，加入含不同浓度的高良姜挥发油药液（100、200、400、600、800μg/mL）处理，同时设置DMSO溶剂对照组，每一浓度设4个平行孔。继续培养24 h后，每孔加入MTT （5 g/L） 20 μL，继续孵育4 h后每孔加入DMSO 150 μL。在微型振荡器上避光振荡20 min，结晶完全溶解后，立即用酶标仪在波长为570 nm检测OD值，以空白孔调零。实验每组重复3次。根据公式计算细胞增殖率：细胞增殖率（%） =加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100%，并计算其半数抑制浓度（ IC50 ）。
1.4 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件包One-Way ANOVA进行统计学处理 。实验数据以mean±SD表示，P<0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 高良姜水提取物对三种人肿瘤细胞株的增殖的抑制作用
结果显示高良姜水提取物可呈剂量依赖性抑制不同肿瘤细胞的增殖，其中对Hela细胞株比HepG2、Capam-2的抑制效果更明显，见图1。
图1 高良姜水提取物对三种肿瘤细胞增殖的影响
2.2 高良姜正丁醇提取物对三种人肿瘤细胞株的增殖的抑制作用
结果显示高良姜水提取物可呈剂量依赖性抑制不同肿瘤细胞的增殖，其中对Hela细胞株比HepG2、Capam-2的抑制效果更明显，见图2。
图2 高良姜正丁醇提取物对三种肿瘤细胞增殖的影响
2.3 高良姜氯仿提取物对三种人肿瘤细胞株的增殖的抑制作用
结果显示高良姜水提取物可呈剂量依赖性抑制不同肿瘤细胞的增殖，其中对HepG2细胞株比Hela、Capam-2的抑制效果更明显，见图3。
图3 高良姜氯仿提取物对对三种肿瘤细胞增殖的影响
2.4 高良姜不同提取物对三种肿瘤细胞的IC50比较
结果显示高良姜氯仿提取物抑制不同肿瘤细胞的IC50明显低于高良姜正丁醇提取物和水提取物，可见其比这两种提取物抗肿瘤活性高，可说明高良姜抗肿瘤活性成分存在于氯仿提取物中，主要为非极性物质。
图4 不同高良姜提取物对三种肿瘤细胞IC50的影响
3.讨论
中药资源丰富，从中药中寻找抗癌活性成分是很好的药物前体或新药开发途径[5]。高良姜作为中药材原料丰富，价格相对便宜，可食药兼用，毒副作用小。在医学上有帮助消化、健胃及治疗冻疮、灼伤、驱蚊杀菌等用途，高良姜除药用外还大量用作调味料，是多种食品的重要原料，还可用于制造保健饮料和日常护理品。目前高良姜中黄酮类化合物抗肿瘤作用研究逐渐备受关注。Lu等[6]的研究表明，高良姜总黄酮和高良姜素能明显抑制B16大鼠黑色素瘤细胞中黑色素的合成，防止皮肤癌发生。Moon等[7]研究显示高良姜素能有效降低甲基亚硝基脲对小鼠肺细胞染色体的致畸作用，并且其提取物能抑制7，12-二甲基苯并蒽引起的小鼠细胞畸变作用。而对于促癌物质TPA诱发的小鼠耳部水肿，高良姜的甲醇提取物表现出明显抑制作用[8]。高良姜提取物能有效增加人结肠癌CaCo-2细胞渗透性并降低上皮细胞的电阻[9]。常徽等[10]发现高良姜药材中的槲皮素等成分能对HL-60细胞株的增殖有抑制作用。最近研究显示，高良姜素抑制人肺癌A549细胞生长[11]，抑制缺氧诱导肺癌NCI-H157细胞合成血管生长因子。我们课题组研究发现高良姜挥发油能抑制多种实体瘤癌细胞的增殖[12]，高良姜素抑制多种肝癌细胞生长，可能通过线粒体途径诱导细胞发生凋亡[13] 。本实验研究结果显示高良姜水提取物、正丁醇提取物和氯仿提取物能呈剂量依赖性抑制不同肿瘤细胞的增殖，且其抗肿瘤活性与提取溶剂的极性成反比，即提取溶剂的极性越小其提取出的物质成分的抗肿瘤活性更强，说明有效抗肿瘤成分主要是非极性成分。研究开发道地南药高良姜抗肿瘤有效成分，将扩大高良姜的应用范围增加其附加值，将具有良好的市场前景和提高当地的经济效益，应需加以开发深入研究。 参考文献：
1.朱家； 何伟； 马建春， 高良姜的研究进展. 食品与药品 2009， 11 （9）， 68.
2.罗辉； 蔡春， 高良姜化学成分研究. 中药材 1998， 21 （7）， 349-351.
3.吕玮； 蒋伶活， 高良姜的化学成分及药理作用. 中国药业 2006， 15 （3）， 19-21.
4.黄慧珍； 杨丹， 高良姜的化学成分及其药理活性研究进展. 广东化工 2009， 36 （1）， 77-80.
5.张珂； 马胜林， 天然药物抗肿瘤机制的研究进展. 中华中医药杂志 2011， 26 （10）， 2344-2347.
6.Lu， Y.-h.； Lin-Tao； Wang， Z.-t.； Wei， D.-z.； Xiang， H.-b.， Mechanism and inhibitory effect of galangin and its flavonoid mixture from Alpinia officinarum on mushroom tyrosinase and B16 murine melanoma cells. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2007， 22 （4）， 433-438.
7.Heo， M. Y.； Sohn， S. J.； Au， W. W.， Anti-genotoxicity of galangin as a cancer chemopreventive agent candidate. Mutation Research/Reviews in Mutation Research 2001， 488 （2）， 135-150.
8.安川宪， 高良姜的抗促癌作用. 国外医学： 中医中药分册 2003， 25 （1）， 53-53.
9.Konishi， Y.， Modulations of food-derived substances on intestinal permeability in Caco-2 cell monolayers. Bioscience， biotechnology， and biochemistry 2003， 67 （10）， 2297-2299.
10.常徽； 糜漫天； 顾艳艳； 袁家林； 凌文华； 林辉， 植物黄酮抗人白血病 HL-60 细胞增殖的结构-效应关系. 癌症 2007， 26 （12）， 1309-1314.
11.Ludwiczuk， A.； Saha， A.； Kuzuhara， T.； Asakawa， Y.， Bioactivity guided isolation of anticancer constituents from leaves of Alnus sieboldiana （Betulaceae）. Phytomedicine 2011， 18 （6）， 491-498.
12. 李寧； 熊勇； 张海涛； 贾振斌； 罗辉， 高良姜挥发油对不同肿瘤细胞株增殖的影响. 山东医药 2012， 52 （11）， 19-21.
13. Zhang， H.-T.； Wu， J.； Wen， M.； Su， L.-J.； Luo， H.， Galangin induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells through the caspase 8/t-Bid mitochondrial pathway. Journal of Asian natural products research 2012， 14 （7）， 626-633.