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摘要：为了确定Cry9Aa3蛋白对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和小菜蛾（Plutella xylostella）的最小活性区，根据NCBI BLAST比对结果与SWISSMODEL同源建模结果，设计了12对截短引物，以cry9Aa3全长序列为模板，扩增出了12种不同截短片段，与pEB载体重组后的阳性克隆，转入大肠杆菌（Escherichia coli）菌株Rosetta（DE3）诱导表达，提取蛋白。对小菜蛾和亚洲玉米螟的生物学活性测定，发现截短蛋白Cry9Aa345～700、Cry9Aa31～654，对小菜蛾和亚洲玉米螟有较高的活性，其中截短蛋白Cry9Aa345～700对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为5.27、7.56 μg/g，截短蛋白Cry9Aa31～654对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为7.76、7.79 μg/g，与阳性对照无显著差异，而截短蛋白Cry9Aa31～653和Cry9Aa346～700（LC50>200 μg/g）对幼虫几乎丧失生物学活性。这说明Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的杀虫活性区相同，最小活性区位于45I和654P之间。
关键词：苏云金芽胞杆菌； Cry9Aa3蛋白； 最小活性区； 小菜蛾； 亚洲玉米螟
中图分类号： Q 753
文献标识码： A
自从1981年第一个Bt cry类基因被克隆[1]，目前已克隆出771个Bt cry类基因（http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil-Crickmore/Bt/）。由于其具有对非靶标害虫无毒，对环境安全等特点[12]，而广泛用于转基因作物[3]。随着转cry1A类基因作物的大面积种植[45]，害虫对Cry1A类蛋白产生了抗性[67]，而Cry9类蛋白与Cry1A类蛋白无交互抗性[8]，因此cry9类基因具有广阔的应用前景。
目前，已发现36个cry9类基因（http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil-Crickmore/Bt/）。在第三等级上分为13类：cry9Aa、cry9Ba、cry9Bb、cry9Ca、cry9Da、cry9Db、cry9Ea、cry9Eb、cry9Ec、cry9Ed、cry9Ee、cry9Fa、cry9Ga，其中Cry9Bb蛋白对烟草天蛾（Manduca sexta）、大豆黧豆毛虫（Velvetbean caterpillar）[9]等有活性；Cry9Ca蛋白对云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）[10]、夜小卷蛾（Epinotia aporema）[11]、烟草天蛾（Manduca sexta）[12]、欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）[13]等有杀虫活性，Cry9Eb、Cry9Ee和Cry9Ec蛋白对小菜蛾[1415]有活性，而Cry9Aa蛋白对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）[8]、小菜蛾[16]、大蜡螟（Galleria mellonella）、欧洲松带蛾（Thaumetopoea pityocampa）[17]、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[18]等多种鳞翅目害虫具有杀虫活性，应用价值较高。cry9Aa3是本实验室从Bt菌株SC5D2中分离而来，对小菜蛾和亚洲玉米螟有较高活性，且与Cry1Ac蛋白无交互抗性[8]，是抗虫转基因作物理想的候选基因。
研究表明，在转Bt基因的过程中，全长的cry类基因表达水平较低，截短的片段表达水平较高[1920]。因此，当Bt基因用于转化植物之前，确定其最小活性区是十分必要的。国内外对Cry蛋白最小活性区的研究报道已经很多，主要包括两种方法：1）通过截短的方法确定最小活性区，如Cry1Ah蛋白（最小活性区位于50I与639E之间）[21]、Cry1Ba3蛋白（最小活性区位于22M～655L之间[22]、Cry1Ie1最小活性区位于活性区位于45M～648E之间[23]；2）蛋白经胰蛋白酶消化，纯化后再进行N端测序，如Cry2Aa经酶解后形成50 kDa片段[24]；Cry1Ac的最小活性区位于28R与623K之间[2526]。
本文研究了Cry9Aa3蛋白12种不同长度的片段对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区域，为Cry9Aa杀虫机理研究以及cry9Aa的商业化应用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 菌株
Rosetta （DE3） （Stratagene）、SC5D2菌株（含有cry9Aa3的重组菌株）、pEB载体（氨苄抗性T7启动子）。
1.2 序列分析和引物设计
根据cry9Aa3序列（GenBank登录号：GQ249293），用DNAMAN分析工具获得翻译蛋白序列，提交于二级预测网站（http：∥www.biogem.org/tool/choufasman/）预测二级结构，并用SWISSMODEL在线建模工具模拟Cry9Aa3蛋白的三级结构，综合考虑二级结构和三级结构预测结果，设计如下几对引物（表1）。在线（http：∥web.expasy.org/compute_pi/）分析各截短片段的PI值和分子量，并用Harrison两个参数的统计学模型预测重组蛋白表达的可溶性[27]。
1.3 基因的扩增、克隆及序列的测定
以菌株SC5D2质粒DNA为模板，利用Primerstar高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环。将回收纯化的PCR产物克隆到pEB载体[28]，筛选出正确的阳性转化子并测序（北京华大基因有限公司）。 1.4 Cry9Aa截短蛋白的表达和SDSPAGE分析
将鉴定正确的重组质粒转入表达菌株Rosetta （DE3）在菌体A600 nm为0.5时，加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG，16 ℃、150 r/min诱导12 h进行表达。在4 ℃、12 000 g离心收集菌体，用20 mmol/L TrisHCl（pH 8.0）缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎（美国SonicsVCX500），超声条件：功率70%，超声10 min（处理5 s停5 s）。然后分别将可溶组分和不可溶组分进行SDSPAGE分离。蛋白电泳样品制备与SDSPAGE电泳检测参见Sambrook等的方法[29]。
1.5 生物活性的分析
供试昆虫：小菜蛾（Plutella xylostella）由本实验室提供；亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）由绽诺思特公司提供。
对于有活性的截短蛋白，选取蛋白终浓度为0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9 μg/g作为生测浓度，对于丧失活性的截短蛋白，选取200 μg/g作为生测浓度，并以只有pEB载体Rosetta菌株作为阴性对照。亚洲玉米螟生测[30]使用人工饲料，小菜蛾[28]生测使用甘蓝菜叶。生测数据采用SPSS 13.0软件计算LC50[31]。
2 结果与分析
2.1 信息学结果
2.1.1 序列特征
Cry9Aa3蛋白存在3个保守结构域，即Domain I由N端第60～290位共231个氨基酸组成；Domain II由第295～508位共214个氨基酸组成；Domain Ⅲ由第513～655位共143个氨基酸组成。因此，其最小活性区可能位于60V～655V。
2.1.2 预测的二级结构
预测该蛋白的N端二级构型应该是α螺旋，α′2螺旋与三级结构所预测的α1螺旋存在叠合区域（图1）。据此，推测α′2螺旋可能会影响该蛋白的活性，而45位氨基酸是α′2螺旋的起始氨基酸（图1），它可能对维持蛋白活性有重要作用，它的缺失可能会引起蛋白活性的丧失。β′1折叠与预测的三级结构的β23折叠基本重合，只在C端有一个氨基酸的差异（655位）。
2.1.3 预测的三级结构
根据SWISSMODEL预测的三级结构，Cry9Aa3蛋白3个结构域位于54D与655V之间（图2）。最终，根据以上预测结果，确定了44、45、46、54、60、70、652、653、654、655、700共11个截短位点。
2.2 不同截短片段的克隆与检测
按表2中的引物对，进行PCR扩增，得到不同长度的cry9Aa3的基因片段（图略）。将PCR产物酶切消化后分别与pEB载体连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选出正确的阳性克隆，并提取质粒。
2.3 表达的片段及其性质分析
不同长度的cry9Aa3基因在Rosetta菌株中都有表达（图3、4），根据不同蛋白的分子量（表2），可知Cry9Aa31～700蛋白比Cry9Aa31～1151截短蛋白小，而比其他的截短片段大，而其他的截短片段之间分子量差异很小，这与图2中蛋白大小趋势符合。此外，所有截短蛋白分子量都比经胰蛋白酶消化后所形成的片段大（图4）。根据表2中CVCV′值，所有截短蛋白的CVCV′>0，这时，P表示不可溶性概率，P值越大表示该蛋白在过表达时，不可溶的可能性越大，而表2中截短蛋白相对全长蛋白P值小，说明截短蛋白的可溶性优于全长蛋白。据此，可能会得到上清表达量较高的截短蛋白，而图4中的Cry9Aa31～654、Cry9Aa31～655蛋白上清表达量明显高于全长蛋白，符合预测的结果。
表3中阳性对照Cry9Aa31～1151对小菜蛾（LC502.63 μg/g）和亚洲玉米螟（LC505.34 μg/g）的毒力都较高，且截短蛋白Cry9Aa31～700、Cry9Aa31～654、Cry9Aa31～655、Cry9Aa344～700、Cry9Aa345～700对小菜蛾和亚洲玉米螟的毒力与阳性对照差异不显著（P>0.05），而截短蛋白Cry9Aa31～653、Cry9Aa31～652、Cry9Aa346～700、Cry9Aa354～700、Cry9Aa360～700、Cry9Aa370～700对小菜蛾和亚洲玉米螟几乎丧失活性。因此，可以确定，Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区位于45I～654P之间。
3 讨论
1991年，第一个cry9Aa基因就被克隆[32]，但至今关于Cry9Aa蛋白机理研究的文章难觅，主要原因可能是Cry9Aa蛋白的表达存在问题。Cry9Aa蛋白在Bt无晶体突变体中不表达，在大肠杆菌中主要是以包涵体的形式存在，在上清中表达量极低（未发表资料），无法纯化和用于杀虫机理研究。本研究通过可溶性预测模型[27]对各截短片段的可溶性进行预测，发现截短蛋白相对于全长蛋白，其可溶性的概率提高，说明其上清表达量比全长蛋白高。所有Cry9Aa3截短蛋白上清表达量都高于Cry9Aa3全长蛋白表达量（图4），其中Cry9Aa31～654、Cry9Aa31～655蛋白相对其他截短蛋白可溶性比例提高最为显著，与预测结果相符，这为推进Cry9Aa蛋白的机理研究奠定了基础。本研究还发现截短的Cry9Aa3蛋白的pI值为8.1左右，而Cry2Ab4蛋白的预测pI值为8.73（http：∥web.expasy.org/compute_pi/），这两者同属于弱碱性蛋白，它们是否存在相似的杀虫机制，以及Cry2Ab的晶体辅助蛋白是否能辅助Cry9Aa3截短蛋白在HD73无晶体突变株表达，这些都值得进一步探索。
目前，已有9种Cry/Cyt蛋白的晶体结构被解析，如CrylAa、Cry2Aa、Cry3Aa、Cry4Aa等[3336]。由于Cry9Aa蛋白与现在已解析三维空间结构的Cry蛋白的氨基酸序列相似性低（30%左右），在同源建模的过程中无合适的模板，故所建模型准确度较低（ERRAT http：∥services.mbi.ucla.edu/SAVES/，得分为44.874）。因此，本研究综合考虑三级结构和二级结构预测结果，设计700、655、654、653、652、54、60、70、46、45、44十一个截短位点，在C端截至654位氨基酸时有活性，而截至653位时丧失活性，结合图2，655位氨基酸的缺失并不影响Domain Ⅲ的β23结构的完整性；而654位氨基酸的缺失会影响DomainⅢ的β23结构的完整性[37]，这说明Domain Ⅲ中的β23折叠片，是保持Domain Ⅲ功能所不可缺少的部分，这与Cry1Ba截短试验的结论一致[22]。而在N端截至45位时，该截短蛋白有活性，而截至46位时，其活性丧失，根据预测的二级结构的结果，46位氨基酸是α′2螺旋的起始氨基酸，截去该氨基酸会影响此螺旋的完整性，再结合预测的三级结构结果，二级结构的α′2螺旋应该是三级结构的α1螺旋，说明α1螺旋是维持蛋白杀虫活性的重要结构。这与某些蛋白的结论相似，如Cry1AMod毒素，它缺失α1螺旋，影响其对敏感昆虫的杀虫活性[38]；而与另一些蛋白的结论相矛盾，如Cry2Aa蛋白和Cry5Ba蛋白，它们都缺失α4螺旋前的所有区域，仍然具有杀虫活性[24，39]。综上所述，α螺旋对蛋白活性的影响与蛋白的种类有关，今后需要更多的实验证据来验证。 本研究最小活性区的确定为高效多价工程菌和转基因作物的研制创造了有利条件，具有重要的理论意义和应用价值。
参考文献
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关键词：苏云金芽胞杆菌； Cry9Aa3蛋白； 最小活性区； 小菜蛾； 亚洲玉米螟
中图分类号： Q 753
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目前，已发现36个cry9类基因（http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil-Crickmore/Bt/）。在第三等级上分为13类：cry9Aa、cry9Ba、cry9Bb、cry9Ca、cry9Da、cry9Db、cry9Ea、cry9Eb、cry9Ec、cry9Ed、cry9Ee、cry9Fa、cry9Ga，其中Cry9Bb蛋白对烟草天蛾（Manduca sexta）、大豆黧豆毛虫（Velvetbean caterpillar）[9]等有活性；Cry9Ca蛋白对云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）[10]、夜小卷蛾（Epinotia aporema）[11]、烟草天蛾（Manduca sexta）[12]、欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）[13]等有杀虫活性，Cry9Eb、Cry9Ee和Cry9Ec蛋白对小菜蛾[1415]有活性，而Cry9Aa蛋白对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）[8]、小菜蛾[16]、大蜡螟（Galleria mellonella）、欧洲松带蛾（Thaumetopoea pityocampa）[17]、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[18]等多种鳞翅目害虫具有杀虫活性，应用价值较高。cry9Aa3是本实验室从Bt菌株SC5D2中分离而来，对小菜蛾和亚洲玉米螟有较高活性，且与Cry1Ac蛋白无交互抗性[8]，是抗虫转基因作物理想的候选基因。
研究表明，在转Bt基因的过程中，全长的cry类基因表达水平较低，截短的片段表达水平较高[1920]。因此，当Bt基因用于转化植物之前，确定其最小活性区是十分必要的。国内外对Cry蛋白最小活性区的研究报道已经很多，主要包括两种方法：1）通过截短的方法确定最小活性区，如Cry1Ah蛋白（最小活性区位于50I与639E之间）[21]、Cry1Ba3蛋白（最小活性区位于22M～655L之间[22]、Cry1Ie1最小活性区位于活性区位于45M～648E之间[23]；2）蛋白经胰蛋白酶消化，纯化后再进行N端测序，如Cry2Aa经酶解后形成50 kDa片段[24]；Cry1Ac的最小活性区位于28R与623K之间[2526]。
本文研究了Cry9Aa3蛋白12种不同长度的片段对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区域，为Cry9Aa杀虫机理研究以及cry9Aa的商业化应用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 菌株
Rosetta （DE3） （Stratagene）、SC5D2菌株（含有cry9Aa3的重组菌株）、pEB载体（氨苄抗性T7启动子）。
1.2 序列分析和引物设计
根据cry9Aa3序列（GenBank登录号：GQ249293），用DNAMAN分析工具获得翻译蛋白序列，提交于二级预测网站（http：∥www.biogem.org/tool/choufasman/）预测二级结构，并用SWISSMODEL在线建模工具模拟Cry9Aa3蛋白的三级结构，综合考虑二级结构和三级结构预测结果，设计如下几对引物（表1）。在线（http：∥web.expasy.org/compute_pi/）分析各截短片段的PI值和分子量，并用Harrison两个参数的统计学模型预测重组蛋白表达的可溶性[27]。
1.3 基因的扩增、克隆及序列的测定
以菌株SC5D2质粒DNA为模板，利用Primerstar高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环。将回收纯化的PCR产物克隆到pEB载体[28]，筛选出正确的阳性转化子并测序（北京华大基因有限公司）。 1.4 Cry9Aa截短蛋白的表达和SDSPAGE分析
将鉴定正确的重组质粒转入表达菌株Rosetta （DE3）在菌体A600 nm为0.5时，加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG，16 ℃、150 r/min诱导12 h进行表达。在4 ℃、12 000 g离心收集菌体，用20 mmol/L TrisHCl（pH 8.0）缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎（美国SonicsVCX500），超声条件：功率70%，超声10 min（处理5 s停5 s）。然后分别将可溶组分和不可溶组分进行SDSPAGE分离。蛋白电泳样品制备与SDSPAGE电泳检测参见Sambrook等的方法[29]。
1.5 生物活性的分析
供试昆虫：小菜蛾（Plutella xylostella）由本实验室提供；亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）由绽诺思特公司提供。
对于有活性的截短蛋白，选取蛋白终浓度为0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9 μg/g作为生测浓度，对于丧失活性的截短蛋白，选取200 μg/g作为生测浓度，并以只有pEB载体Rosetta菌株作为阴性对照。亚洲玉米螟生测[30]使用人工饲料，小菜蛾[28]生测使用甘蓝菜叶。生测数据采用SPSS 13.0软件计算LC50[31]。
2 结果与分析
2.1 信息学结果
2.1.1 序列特征
Cry9Aa3蛋白存在3个保守结构域，即Domain I由N端第60～290位共231个氨基酸组成；Domain II由第295～508位共214个氨基酸组成；Domain Ⅲ由第513～655位共143个氨基酸组成。因此，其最小活性区可能位于60V～655V。
2.1.2 预测的二级结构
预测该蛋白的N端二级构型应该是α螺旋，α′2螺旋与三级结构所预测的α1螺旋存在叠合区域（图1）。据此，推测α′2螺旋可能会影响该蛋白的活性，而45位氨基酸是α′2螺旋的起始氨基酸（图1），它可能对维持蛋白活性有重要作用，它的缺失可能会引起蛋白活性的丧失。β′1折叠与预测的三级结构的β23折叠基本重合，只在C端有一个氨基酸的差异（655位）。
2.1.3 预测的三级结构
根据SWISSMODEL预测的三级结构，Cry9Aa3蛋白3个结构域位于54D与655V之间（图2）。最终，根据以上预测结果，确定了44、45、46、54、60、70、652、653、654、655、700共11个截短位点。
2.2 不同截短片段的克隆与检测
按表2中的引物对，进行PCR扩增，得到不同长度的cry9Aa3的基因片段（图略）。将PCR产物酶切消化后分别与pEB载体连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选出正确的阳性克隆，并提取质粒。
2.3 表达的片段及其性质分析
不同长度的cry9Aa3基因在Rosetta菌株中都有表达（图3、4），根据不同蛋白的分子量（表2），可知Cry9Aa31～700蛋白比Cry9Aa31～1151截短蛋白小，而比其他的截短片段大，而其他的截短片段之间分子量差异很小，这与图2中蛋白大小趋势符合。此外，所有截短蛋白分子量都比经胰蛋白酶消化后所形成的片段大（图4）。根据表2中CVCV′值，所有截短蛋白的CVCV′>0，这时，P表示不可溶性概率，P值越大表示该蛋白在过表达时，不可溶的可能性越大，而表2中截短蛋白相对全长蛋白P值小，说明截短蛋白的可溶性优于全长蛋白。据此，可能会得到上清表达量较高的截短蛋白，而图4中的Cry9Aa31～654、Cry9Aa31～655蛋白上清表达量明显高于全长蛋白，符合预测的结果。
表3中阳性对照Cry9Aa31～1151对小菜蛾（LC502.63 μg/g）和亚洲玉米螟（LC505.34 μg/g）的毒力都较高，且截短蛋白Cry9Aa31～700、Cry9Aa31～654、Cry9Aa31～655、Cry9Aa344～700、Cry9Aa345～700对小菜蛾和亚洲玉米螟的毒力与阳性对照差异不显著（P>0.05），而截短蛋白Cry9Aa31～653、Cry9Aa31～652、Cry9Aa346～700、Cry9Aa354～700、Cry9Aa360～700、Cry9Aa370～700对小菜蛾和亚洲玉米螟几乎丧失活性。因此，可以确定，Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区位于45I～654P之间。
3 讨论
1991年，第一个cry9Aa基因就被克隆[32]，但至今关于Cry9Aa蛋白机理研究的文章难觅，主要原因可能是Cry9Aa蛋白的表达存在问题。Cry9Aa蛋白在Bt无晶体突变体中不表达，在大肠杆菌中主要是以包涵体的形式存在，在上清中表达量极低（未发表资料），无法纯化和用于杀虫机理研究。本研究通过可溶性预测模型[27]对各截短片段的可溶性进行预测，发现截短蛋白相对于全长蛋白，其可溶性的概率提高，说明其上清表达量比全长蛋白高。所有Cry9Aa3截短蛋白上清表达量都高于Cry9Aa3全长蛋白表达量（图4），其中Cry9Aa31～654、Cry9Aa31～655蛋白相对其他截短蛋白可溶性比例提高最为显著，与预测结果相符，这为推进Cry9Aa蛋白的机理研究奠定了基础。本研究还发现截短的Cry9Aa3蛋白的pI值为8.1左右，而Cry2Ab4蛋白的预测pI值为8.73（http：∥web.expasy.org/compute_pi/），这两者同属于弱碱性蛋白，它们是否存在相似的杀虫机制，以及Cry2Ab的晶体辅助蛋白是否能辅助Cry9Aa3截短蛋白在HD73无晶体突变株表达，这些都值得进一步探索。
目前，已有9种Cry/Cyt蛋白的晶体结构被解析，如CrylAa、Cry2Aa、Cry3Aa、Cry4Aa等[3336]。由于Cry9Aa蛋白与现在已解析三维空间结构的Cry蛋白的氨基酸序列相似性低（30%左右），在同源建模的过程中无合适的模板，故所建模型准确度较低（ERRAT http：∥services.mbi.ucla.edu/SAVES/，得分为44.874）。因此，本研究综合考虑三级结构和二级结构预测结果，设计700、655、654、653、652、54、60、70、46、45、44十一个截短位点，在C端截至654位氨基酸时有活性，而截至653位时丧失活性，结合图2，655位氨基酸的缺失并不影响Domain Ⅲ的β23结构的完整性；而654位氨基酸的缺失会影响DomainⅢ的β23结构的完整性[37]，这说明Domain Ⅲ中的β23折叠片，是保持Domain Ⅲ功能所不可缺少的部分，这与Cry1Ba截短试验的结论一致[22]。而在N端截至45位时，该截短蛋白有活性，而截至46位时，其活性丧失，根据预测的二级结构的结果，46位氨基酸是α′2螺旋的起始氨基酸，截去该氨基酸会影响此螺旋的完整性，再结合预测的三级结构结果，二级结构的α′2螺旋应该是三级结构的α1螺旋，说明α1螺旋是维持蛋白杀虫活性的重要结构。这与某些蛋白的结论相似，如Cry1AMod毒素，它缺失α1螺旋，影响其对敏感昆虫的杀虫活性[38]；而与另一些蛋白的结论相矛盾，如Cry2Aa蛋白和Cry5Ba蛋白，它们都缺失α4螺旋前的所有区域，仍然具有杀虫活性[24，39]。综上所述，α螺旋对蛋白活性的影响与蛋白的种类有关，今后需要更多的实验证据来验证。 本研究最小活性区的确定为高效多价工程菌和转基因作物的研制创造了有利条件，具有重要的理论意义和应用价值。
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