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摘要：【目的】分析十大功劳属6个种的遗传多样性及亲缘关系，为其资源保护和开发利用提供参考依据。【方法】采集十大功劳属6个种植物样品，提取基因组DNA，采用优化的RAPD反应体系和条件进行多态性检测，分析多态性条带规律，并用NTSYS-pc Version 2.11a进行数据分析，计算遗传相似系数，用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，生成聚类图。【结果】十大功劳属6个种的21条重复性好、稳定性高的有效引物共扩增出264条条带，其中多态性条带234条，多态性比例为88.64%，多态性信息含量（PIC）为0.373～0.414；6个种的遗传相似系数为0.45～0.78。UPGMA聚类分析结果表明，在遗传相似系数0.53处，6个种可分为3个组，其中阔叶十大功劳M. bealei和小果十大功劳M. bodinieri Gagnep.为一组，靖西全缘叶十大功劳M. jingxiensis为一组，其他3个种为一组；在遗传相似系数0.59处，细叶十大功劳M. fortunei单独为一组，长柱十大功劳M. duclouxiana Gagnep.和靖西十大功劳M. subimbricata W. Y. Chun et F. Chun为一组。【结论】十大功劳属6个种植物具有较丰富的遗传多样性，部分种之间有较近的亲缘关系。
关键词： 十大功劳；遗传多样性；亲缘关系；RAPD；聚类分析
中图分类号： S567.19 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1077-06
0 引言
【研究意义】十大功劳是小檗科十大功劳属（Mahonia）植物，拥有约60个种，其中在我国发现有35个种，主要分布在广西、四川、云南及西藏等地（余天虹等，2015）。十大功劳有清热燥湿、泻火解毒等功效，可用于治疗湿热泻痢、黄疸、目赤肿痛、胃火牙痛、痢疾及黄疸型肝炎等（陈明生等，2014），药用价值极高，是“功劳去火片”、“妇科千金片”等中药制剂或中成药的主要原料（He and Mu，2015），市场需求量越来越大，而目前能用于制药的十大功劳仅有阔叶十大功劳（Mahonia bealei）或细叶十大功劳（M. fortunei）的干燥茎，其资源极其缺乏，且极少人工大面积种植。因此，研究十大功劳的种质遗传多样性，明确不同种十大功劳间的亲缘关系，以寻找阔叶十大功劳或细叶十大功劳的替代品，扩大功劳木的药材来源，对其资源的保护和合理开发利用具有重要意义。【前人研究进展】随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）是一种以电泳和PCR为核心的分子标记技术（蒋向辉和佘朝文，2011；杨学明等，2011），具有灵敏度高、模板用量少、成本低、获取信息量大等优点（陈集成等，2014），目前已广泛应用于动植物资源鉴定、亲缘关系分析及遗传多样性分析等（张敏莹等，2013；陈天青等，2015；兰琴英等，2015）。Esmaeelkhanian等（2007）运用RAPD分析方法对伊朗6个品种山羊的遗传多样进行分析，确定其亲缘关系，并得到了聚类分析图。Khan等（2008）研究表明，RAPD分子标记技术能简单快速地分析野生芥菜（Brassica juncea）的亲缘关系和种质遗传变异情况。朱学峰（2011）提取7只广西中华草龟的基因组DNA，利用RAPD技术对其遗传多样性进行分析，为广西草龟资源的合理开发利用和保护提供了科学依据。江文等（2012）利用RAPD分子标记技术分析了24个荸荠地方品种的亲缘关系及遗传多样性，为荸荠品种资源研究和选育提供理论依据。徐婧等（2012）采用单因子试验和正交设计方法，对阔叶十大功劳ISSR-PCR反应体系进行优化，为探讨阔叶十大功劳种质遗传多样性打下了基础。夏叶等（2014）通过ITS2测序建立了十大功劳与其近缘易混品种的鉴别方法。【本研究切入点】目前，国内外关于十大功劳的研究主要集中在藥效方面（Miyasaki et al.，2013；Zhang et al.，2014），针对遗传多样性及亲缘关系的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】利用RAPD分析方法对6个种十大功劳进行遗传多样性及亲缘关系分析，为十大功劳药材资源的保护和开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
十大功劳属6个种分别为细叶十大功劳M. fortunei、小果十大功劳M. bodinieri Gagnep.（采集于南宁市广西药用植物园）、阔叶十大功劳M. bealei（采集于中国科学院广西植物研究所）、靖西全缘叶十大功劳M. jingxiensis（采集于广西那坡县）、长柱十大功劳M. duclouxiana Gagnep.和靖西十大功劳M. subimbricata W.Y. Chun et F. Chun（采集于广西凌云县），采集其新鲜叶样品后迅速用硅胶干燥保存。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 引物合成与筛选 50条Sangon随机引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，50条Operons随机引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。从中筛选出21条能扩增出清晰条带、重现性好的引物用于RAPD分析。引物序列见表1。
1. 2. 2 DNA提取及检测 采用DNeasy Plant Mini Kit（德国QIAGEN公司）的方法，严格按照试剂盒说明进行DNA提取。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，用酶标仪测定260和280 nm下的OD值，检测DNA的纯度和浓度，稀释成约20.0 ng/μL备用。
1. 2. 3 RAPD反应程序及扩增条件建立 经过反复摸索、正交优化，确定RAPD-PCR反应体系为25.0 μL，其中包括10×Pfu Buffer 2.5 μL（Thermo公司）， MgSO4 2.5 μL（Thermo公司，浓度为25 mmol/L），dNTP 0.5 μL[生工生物工程（上海）股份有限公司，浓度10 mmol/L]， Pfu DNA Polymerase 0.5 μL（Thermo公司，浓度2.5 U/μL），随机引物1.0 μL，模板1.0 μL和ddH2O 17.0 μL。扩增程序：95.0 ℃预变性4 min；95.0 ℃ 1 min，35.4 ℃ 1 min，72.0 ℃ 2 min，进行40个循环；最后72.0 ℃ 延伸10 min。 RAPD-PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶胶（含Goldview I型核酸染色剂）电泳，电压80 V，电泳时间40 min。用Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）凝胶成像系统进行拍照分析。将电泳图谱中有清晰条带且具有重现性的记为1，没有条带或重现性不好的记为0，得到由1和0组成的数据矩阵，统计单位引物扩增的总条带数和多态性条带数，并计算多态性条带百分率。
多态性条带百分率（%）=多态性条带数/总条带数×100
1. 3 统计分析
采用NTSYS-pc Version 2.11a进行数据分析，计算6个种间的遗传相似系数（Genetic similarity coefficient，GSC），用非加权配对算术平均法（Unweighted pair group mean average，UPGMA）进行聚类分析，并生成聚类分析图。
2 结果与分析
2. 1 DNA提取结果
十大功劳属6个种叶片样品提取的DNA经检测A260/A280为1.7～1.9，说明样品的DNA纯度较高。1.0%琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，DNA分子量均在20 kb左右，无明显降解现象。
2. 2 RAPD扩增结果
21条随机引物共扩增出264条条带，其中多态性条带234条，多态性比例为88.64%，表明选取的十大功劳属6个种具有较丰富的遗传多样性。不同引物扩增获得的DNA条带数不同，平均每条引物产生12.57条条带，其中引物OPA9扩增的条带最多，为21条，引物S99和OPB5最少，仅3条（表1）。这些扩增条带大小为200～2000 bp。图2为引物S32和OPB4的RAPD扩增图谱。
参考Roldán-Ruiz等（2000）的方法分析多态性条带的分布规律，计算多态性信息含量（Polymorphic information content，PIC）。从图3可以看出，十大功劳属6个种的平均PIC为：小果十大功劳0.414，细叶十大功劳0.412，阔叶十大功劳0.407，靖西十大功劳0.398，靖西全缘叶十大功劳0.396，长柱十大功劳0.373。
2. 3 遗传相似性评价结果
对21条引物扩增得到条带用NTSYS-pc Version 2.11a计算GSC（表2）。由表2可知，十大功劳属6个种的GSC为0.45～0.78。其中靖西十大功劳和小果十大功劳的GSC最小，为0.45，说明二者的亲缘关系较远；阔叶十大功劳和小果十大功劳的GSC最大，为0.78，推测二者可能具有共同起源或为近缘品种，拥有相似的药用成分。
2. 4 聚类分析结果
运用UPGMA法对十大功劳属6个种的亲缘关系进行聚类分析，得到其聚类树。从图4可以看出，在GSC为0.53处，6个种可分为3个组：阔叶十大功劳和小果十大功劳为一组，靖西全缘叶十大功劳为一组，其他3个种为一组；在GSC为0.59处，细叶十大功劳单独为一组，长柱十大功劳和靖西十大功劳为一组。
3 讨论
植物DNA的提取要求采用新鲜、低温冷冻或硅胶干燥保存的样品，但在远距离采样或采样时受地形环境的限制等很难携带用于样品保鲜的液氮或冰壶，因此，硅胶干燥保存法更加方便实用，且成本较低（李学营等，2006）。本研究曾尝试用CTAB法及国内几个试剂盒的方法提取硅胶干燥保存十大功劳属6个种叶片的基因組DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳并未见DNA条带，增加水浴时间后，DNA降解十分严重，1.0%琼脂糖凝胶电泳呈现弥散状态，与韩玉杰等（2008）的研究结果一致，难以提取获得高质量的DNA。这可能与十大功劳叶片组织含有较多的多糖及酚类、色素等其他次生代谢产物且很难从破碎的植物细胞中抽提出来有关。改用德国QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit方法后，其提取液能充分破碎植物细胞，且采用特制的离心柱法能有效分离多糖及多酚等，最终可得到质量较好的DNA。
一般来说，RAPD扩增产生的每条条带即代表基因中的一个位点（杨瑞武等，2001）。本研究用21条RAPD引物共扩增出264条条带，意味着已经对十大功劳属6个品种基因组的264个位点进行了检查。264条条带中只有30条条带为十大功劳属6个种所共有，十大功劳属6个种的PIC为0.373～0.414，说明十大功劳属6个种存在较丰富的遗传多样性。十大功劳属6个种的GSC为0.45～0.78，其中阔叶十大功劳和小果十大功劳的GSC最大，为0.78，推断二者可能具有共同起源或为近缘品种，因此，可以考虑将小果十大功劳作为阔叶十大功劳的替代品用作药材，但其药效学、毒理学研究还需进一步证实。
以RAPD数据为基础的聚类分析是植物分类鉴别的重要依据。王艇等（2001）通过RAPD数据分析，构建了小檗属、十大功劳属等5个属6种植物的聚类分析图，结果显示阔叶十大功劳是独立的一个属，与小檗属的绿叶小檗、猫儿刺不能聚为一类，说明在小檗科内建立十大功劳属较合理。本研究中的聚类分析结果显示，在GSC为0.53时，十大功劳属6个种可分为3个组：阔叶十大功劳和小果十大功劳为一组，靖西全缘叶十大功劳为一组，其他3个种为一组；当GSC为0.59时，细叶十大功劳单独为一组，长柱十大功劳和靖西十大功劳为一组。这与对十大功劳的形态学观察结果（Wu et al.，2009）既有一致性也存在一定差异。阔叶十大功劳和小果十大功劳叶片形态相似，叶缘有粗大的刺锯齿，二者聚为一组与形态学观察结果基本相符；靖西全缘叶十大功劳叶片全缘无锯齿，与其他品种有显著区别，将其聚为独立的一组有一定的合理性；长柱十大功劳的花柱长达3 mm，花序长8～30 cm（中国科学院中国植物志编辑委员会，2001），与其他品种有明显区别，可独立为一组，将其与靖西十大功劳聚在一起，与形态学观察结果比较存在一定的偏差。 RAPD分析标记技术存在一些不足，其中最突出的是稳定性较差，本研究通过严格控制RAPD-PCR反应酶、模板DNA、dNTP及Mg2+等关键因素的质量，经过反复摸索、正交优化，确定RAPD-PCR反应体系和扩增程序对100条随机引物进行筛选，最终得到较稳定且可重现的分析结果。可见，RAPD分子标记技术能较好地应用于对十大功劳植物遗传多样性和亲缘关系的分析。
4 结论
十大功劳属6个种植物具有较丰富的遗传多样性，部分种之间亲缘关系较近，可作为今后开展人工选育优质十大功劳药材研究的参考依据。
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（責任编辑 思利华）
关键词： 十大功劳；遗传多样性；亲缘关系；RAPD；聚类分析
中图分类号： S567.19 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1077-06
0 引言
【研究意义】十大功劳是小檗科十大功劳属（Mahonia）植物，拥有约60个种，其中在我国发现有35个种，主要分布在广西、四川、云南及西藏等地（余天虹等，2015）。十大功劳有清热燥湿、泻火解毒等功效，可用于治疗湿热泻痢、黄疸、目赤肿痛、胃火牙痛、痢疾及黄疸型肝炎等（陈明生等，2014），药用价值极高，是“功劳去火片”、“妇科千金片”等中药制剂或中成药的主要原料（He and Mu，2015），市场需求量越来越大，而目前能用于制药的十大功劳仅有阔叶十大功劳（Mahonia bealei）或细叶十大功劳（M. fortunei）的干燥茎，其资源极其缺乏，且极少人工大面积种植。因此，研究十大功劳的种质遗传多样性，明确不同种十大功劳间的亲缘关系，以寻找阔叶十大功劳或细叶十大功劳的替代品，扩大功劳木的药材来源，对其资源的保护和合理开发利用具有重要意义。【前人研究进展】随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）是一种以电泳和PCR为核心的分子标记技术（蒋向辉和佘朝文，2011；杨学明等，2011），具有灵敏度高、模板用量少、成本低、获取信息量大等优点（陈集成等，2014），目前已广泛应用于动植物资源鉴定、亲缘关系分析及遗传多样性分析等（张敏莹等，2013；陈天青等，2015；兰琴英等，2015）。Esmaeelkhanian等（2007）运用RAPD分析方法对伊朗6个品种山羊的遗传多样进行分析，确定其亲缘关系，并得到了聚类分析图。Khan等（2008）研究表明，RAPD分子标记技术能简单快速地分析野生芥菜（Brassica juncea）的亲缘关系和种质遗传变异情况。朱学峰（2011）提取7只广西中华草龟的基因组DNA，利用RAPD技术对其遗传多样性进行分析，为广西草龟资源的合理开发利用和保护提供了科学依据。江文等（2012）利用RAPD分子标记技术分析了24个荸荠地方品种的亲缘关系及遗传多样性，为荸荠品种资源研究和选育提供理论依据。徐婧等（2012）采用单因子试验和正交设计方法，对阔叶十大功劳ISSR-PCR反应体系进行优化，为探讨阔叶十大功劳种质遗传多样性打下了基础。夏叶等（2014）通过ITS2测序建立了十大功劳与其近缘易混品种的鉴别方法。【本研究切入点】目前，国内外关于十大功劳的研究主要集中在藥效方面（Miyasaki et al.，2013；Zhang et al.，2014），针对遗传多样性及亲缘关系的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】利用RAPD分析方法对6个种十大功劳进行遗传多样性及亲缘关系分析，为十大功劳药材资源的保护和开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
十大功劳属6个种分别为细叶十大功劳M. fortunei、小果十大功劳M. bodinieri Gagnep.（采集于南宁市广西药用植物园）、阔叶十大功劳M. bealei（采集于中国科学院广西植物研究所）、靖西全缘叶十大功劳M. jingxiensis（采集于广西那坡县）、长柱十大功劳M. duclouxiana Gagnep.和靖西十大功劳M. subimbricata W.Y. Chun et F. Chun（采集于广西凌云县），采集其新鲜叶样品后迅速用硅胶干燥保存。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 引物合成与筛选 50条Sangon随机引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，50条Operons随机引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。从中筛选出21条能扩增出清晰条带、重现性好的引物用于RAPD分析。引物序列见表1。
1. 2. 2 DNA提取及检测 采用DNeasy Plant Mini Kit（德国QIAGEN公司）的方法，严格按照试剂盒说明进行DNA提取。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，用酶标仪测定260和280 nm下的OD值，检测DNA的纯度和浓度，稀释成约20.0 ng/μL备用。
1. 2. 3 RAPD反应程序及扩增条件建立 经过反复摸索、正交优化，确定RAPD-PCR反应体系为25.0 μL，其中包括10×Pfu Buffer 2.5 μL（Thermo公司）， MgSO4 2.5 μL（Thermo公司，浓度为25 mmol/L），dNTP 0.5 μL[生工生物工程（上海）股份有限公司，浓度10 mmol/L]， Pfu DNA Polymerase 0.5 μL（Thermo公司，浓度2.5 U/μL），随机引物1.0 μL，模板1.0 μL和ddH2O 17.0 μL。扩增程序：95.0 ℃预变性4 min；95.0 ℃ 1 min，35.4 ℃ 1 min，72.0 ℃ 2 min，进行40个循环；最后72.0 ℃ 延伸10 min。 RAPD-PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶胶（含Goldview I型核酸染色剂）电泳，电压80 V，电泳时间40 min。用Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）凝胶成像系统进行拍照分析。将电泳图谱中有清晰条带且具有重现性的记为1，没有条带或重现性不好的记为0，得到由1和0组成的数据矩阵，统计单位引物扩增的总条带数和多态性条带数，并计算多态性条带百分率。
多态性条带百分率（%）=多态性条带数/总条带数×100
1. 3 统计分析
采用NTSYS-pc Version 2.11a进行数据分析，计算6个种间的遗传相似系数（Genetic similarity coefficient，GSC），用非加权配对算术平均法（Unweighted pair group mean average，UPGMA）进行聚类分析，并生成聚类分析图。
2 结果与分析
2. 1 DNA提取结果
十大功劳属6个种叶片样品提取的DNA经检测A260/A280为1.7～1.9，说明样品的DNA纯度较高。1.0%琼脂糖凝胶电泳结果（图1）显示，DNA分子量均在20 kb左右，无明显降解现象。
2. 2 RAPD扩增结果
21条随机引物共扩增出264条条带，其中多态性条带234条，多态性比例为88.64%，表明选取的十大功劳属6个种具有较丰富的遗传多样性。不同引物扩增获得的DNA条带数不同，平均每条引物产生12.57条条带，其中引物OPA9扩增的条带最多，为21条，引物S99和OPB5最少，仅3条（表1）。这些扩增条带大小为200～2000 bp。图2为引物S32和OPB4的RAPD扩增图谱。
参考Roldán-Ruiz等（2000）的方法分析多态性条带的分布规律，计算多态性信息含量（Polymorphic information content，PIC）。从图3可以看出，十大功劳属6个种的平均PIC为：小果十大功劳0.414，细叶十大功劳0.412，阔叶十大功劳0.407，靖西十大功劳0.398，靖西全缘叶十大功劳0.396，长柱十大功劳0.373。
2. 3 遗传相似性评价结果
对21条引物扩增得到条带用NTSYS-pc Version 2.11a计算GSC（表2）。由表2可知，十大功劳属6个种的GSC为0.45～0.78。其中靖西十大功劳和小果十大功劳的GSC最小，为0.45，说明二者的亲缘关系较远；阔叶十大功劳和小果十大功劳的GSC最大，为0.78，推测二者可能具有共同起源或为近缘品种，拥有相似的药用成分。
2. 4 聚类分析结果
运用UPGMA法对十大功劳属6个种的亲缘关系进行聚类分析，得到其聚类树。从图4可以看出，在GSC为0.53处，6个种可分为3个组：阔叶十大功劳和小果十大功劳为一组，靖西全缘叶十大功劳为一组，其他3个种为一组；在GSC为0.59处，细叶十大功劳单独为一组，长柱十大功劳和靖西十大功劳为一组。
3 讨论
植物DNA的提取要求采用新鲜、低温冷冻或硅胶干燥保存的样品，但在远距离采样或采样时受地形环境的限制等很难携带用于样品保鲜的液氮或冰壶，因此，硅胶干燥保存法更加方便实用，且成本较低（李学营等，2006）。本研究曾尝试用CTAB法及国内几个试剂盒的方法提取硅胶干燥保存十大功劳属6个种叶片的基因組DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳并未见DNA条带，增加水浴时间后，DNA降解十分严重，1.0%琼脂糖凝胶电泳呈现弥散状态，与韩玉杰等（2008）的研究结果一致，难以提取获得高质量的DNA。这可能与十大功劳叶片组织含有较多的多糖及酚类、色素等其他次生代谢产物且很难从破碎的植物细胞中抽提出来有关。改用德国QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit方法后，其提取液能充分破碎植物细胞，且采用特制的离心柱法能有效分离多糖及多酚等，最终可得到质量较好的DNA。
一般来说，RAPD扩增产生的每条条带即代表基因中的一个位点（杨瑞武等，2001）。本研究用21条RAPD引物共扩增出264条条带，意味着已经对十大功劳属6个品种基因组的264个位点进行了检查。264条条带中只有30条条带为十大功劳属6个种所共有，十大功劳属6个种的PIC为0.373～0.414，说明十大功劳属6个种存在较丰富的遗传多样性。十大功劳属6个种的GSC为0.45～0.78，其中阔叶十大功劳和小果十大功劳的GSC最大，为0.78，推断二者可能具有共同起源或为近缘品种，因此，可以考虑将小果十大功劳作为阔叶十大功劳的替代品用作药材，但其药效学、毒理学研究还需进一步证实。
以RAPD数据为基础的聚类分析是植物分类鉴别的重要依据。王艇等（2001）通过RAPD数据分析，构建了小檗属、十大功劳属等5个属6种植物的聚类分析图，结果显示阔叶十大功劳是独立的一个属，与小檗属的绿叶小檗、猫儿刺不能聚为一类，说明在小檗科内建立十大功劳属较合理。本研究中的聚类分析结果显示，在GSC为0.53时，十大功劳属6个种可分为3个组：阔叶十大功劳和小果十大功劳为一组，靖西全缘叶十大功劳为一组，其他3个种为一组；当GSC为0.59时，细叶十大功劳单独为一组，长柱十大功劳和靖西十大功劳为一组。这与对十大功劳的形态学观察结果（Wu et al.，2009）既有一致性也存在一定差异。阔叶十大功劳和小果十大功劳叶片形态相似，叶缘有粗大的刺锯齿，二者聚为一组与形态学观察结果基本相符；靖西全缘叶十大功劳叶片全缘无锯齿，与其他品种有显著区别，将其聚为独立的一组有一定的合理性；长柱十大功劳的花柱长达3 mm，花序长8～30 cm（中国科学院中国植物志编辑委员会，2001），与其他品种有明显区别，可独立为一组，将其与靖西十大功劳聚在一起，与形态学观察结果比较存在一定的偏差。 RAPD分析标记技术存在一些不足，其中最突出的是稳定性较差，本研究通过严格控制RAPD-PCR反应酶、模板DNA、dNTP及Mg2+等关键因素的质量，经过反复摸索、正交优化，确定RAPD-PCR反应体系和扩增程序对100条随机引物进行筛选，最终得到较稳定且可重现的分析结果。可见，RAPD分子标记技术能较好地应用于对十大功劳植物遗传多样性和亲缘关系的分析。
4 结论
十大功劳属6个种植物具有较丰富的遗传多样性，部分种之间亲缘关系较近，可作为今后开展人工选育优质十大功劳药材研究的参考依据。
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（責任编辑 思利华）