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[摘要] 目的 分析梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）Hsp40蛋白的生物学特性并克隆其基因。 方法 通过GenBank查到Hsp40蛋白的序列，利用生物信息学软件分析其生物学特性。根据Tp Hsp40基因序列设计特异性引物，利用PCR扩增Hsp40基因，并把该DNA片段连接到pMD19-T载体，转化大肠杆菌后挑取阳性克隆采用PCR和DNA测序进行验证。 结果 Tp Hsp40基因能够编码374个氨基酸的蛋白质，其分子量为40.1 kDa，无信号肽，呈亲水性。Swissmodel 预测得到Tp Hsp40的三级结构与嗜热杆菌（Thermus thermophilus）Hsp40结构最接近。从Tp基因组中扩增得到1125 bp的Tp Hsp40基因并将其连接到pMD19-T载体。 结论 本文预测了梅毒螺旋体毒力因子Hsp40蛋白的结构和克隆得到Tp Hsp40基因。
[关键词] 梅毒螺旋体；Hsp40蛋白；生物信息学；基因克隆
[中图分类号] R377 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）20-0041-03
Bioinformatical analysis and gene clone of treponema pallidum Hsp40
WU Xian HE Shuguang LIU Lingzhi CHEN Chaoying ZHU Yixi MO Zuoqun
Clinical Laboratory， First Affiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical College， Zhuzhou 412000， China
[Abstract] Objective To investigate the biological characteristics of treponema pallidum （Tp） Hsp 40 and clone its gene. Methods Protein sequence of Hsp40 was found using GenBank and its biological characteristics were analyzed using bioinformatical software. Specific primer was designed based on the genetic sequence of Tp Hsp40 and PCR was used to amplify the gene of Hsp40. The DNA fragment was ligated to pMD19-T carrier and transformed to Escherichia coli. Positive clones were selected to be verified using PCR and DNA sequencing. Results Gene of Tp Hsp40 could encode a protein of 374 amino acids. The molecular weight of the protein was 40.1 kDa. The protein had no signal peptide and was hydrophilic. The tertiary structure of Tp Hsp40 predicted by Swissmodel was closest to the structure of thermus thermophilus Hsp40. Gene of Tp Hsp40 with 1125bp amplified from genome of Tp was ligated to pMD19-T carrier. Conclusion This paper predicted the structure of Hsp40， the virulence factor of Tp， and cloned the gene of Tp Hsp40.
[Key words] Treponema pallidum； Hsp40； Bioinformatics； Gene clone
梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）是引起梅毒的病原体。研究发现Tp能够感染并破坏成人多种器官，能经胎盘传入胎儿导致先天梅毒，严重者会产生死胎和流产[1，2]。目前我国梅毒患者数量呈增加趋势，仅次于病毒性肝炎和肺结核，在法定甲乙类传染病中排第三位[3-4]。如何有效预防及控制梅毒已成为一个严重的社会问题。在Tp中未发现内毒素等传统的毒力蛋白，但是通过基因工程获得Tp鞭毛蛋白、铁蛋白TpF1、外膜蛋白和趋化蛋白在体外能够诱导细胞产生炎症反应，提示这些蛋白可能是Tp致病中的关键蛋白[5-9]。寻找Tp新的毒力蛋白是研究其致病机制的关键[9]。热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是一组具有保守结构域的蛋白超家族。在细菌受到应激和胁迫时大量表达，帮助细菌适应环境。最近发现Hsp40蛋白在细菌致病过程中可能发挥重要功能[10-13]。我们在Tp的基因组中发现了一个Hsp40同源蛋白，本实验拟采用生物信息学方法分析Hsp40蛋白的生物学特性并克隆得到Hsp40基因，为研究其功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌种和载体
梅毒螺旋体和大肠埃希菌Top10由湖南中医药高等专科学校附属第一医院检验科保存，克隆载体pMD19-T来自宝生物工程（大连）公司。
1.2 主要试剂
T4 DNA连接酶，高保真 DNA聚合酶，DNA marker，限制性内切酶NdeI和HindIII和DNA胶回收试剂盒从宝生物工程（大连）公司购买，细菌DNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。 1.3 Hsp40生物信息学分析
从GenBank中获取梅毒螺旋体（T.pallidum，accession number：NZ_CP003679）的Hsp40基因和蛋白序列。利用Protparam分析Hsp40蛋白的理化特性，采用ProtScale预测其亲水性，采用Swiss-model预测其三级结构。
1.4 Tp Hsp40基因的PCR扩增
依据Tp Hsp40基因序列，设计PCR引物。Hsp40-F：5’-AGCCATATGGTGGCAAAGAAGGATTATTA-3’；和Hsp40-R：5’-CCCAAGCTTCTACTTGAGACTTG-AAA-3’。然后由赛默飞世尔科技公司（广州）进行合成。以提取的梅毒螺旋体DNA为模板进行PCR扩增Hsp40基因片段。PCR体系：5 μL 10×PCR 缓冲液，1 μL引物 Hsp40-F（10 μM），1 μL引物Hsp40-R （10 μM），0.1 μg模板Tp DNA，1 μL DNA聚合酶（2.5 U/μL），1 μL dNTP Mixture（10 mM），最后加入无菌水到50 μL。PCR反应程序为：94℃ 2 min；（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）×30个循环；最后72℃ 5 min。得到的DNA片段进行电泳，然后进行回收。
1.5 pMD19-Hsp40质粒的构建与鉴定
将回收的Hsp40片段与pMD19-T载体相连，获得pMD19-Hsp40重组质粒，然后转化大肠埃希菌Top10，37℃过夜培养。挑单菌落接种到液体LB培养基进行培养，然后使用PCR鉴定，將阳性菌株进行测序。
1.6 统计学方法
SignalP4.1软件预测结果表明Hsp40蛋白无信号肽，使用ProtScale软件预测Hsp40蛋白的亲疏水性，使用在线软件Swissmodel模拟Tp Hsp40蛋白的三级结构。
2 结果
2.1 Tp Hsp40理化特性
利用Protparam分析Hsp40蛋白的理化性质，Hsp40蛋白全长含有374个氨基酸，分子量为40.1 kDa，等电点为8.75。不稳定指数为38.44，表明Hsp40蛋白不容易降解。SignalP4.1软件预测结果表明Hsp40蛋白无信号肽，定位在细菌细胞质。见封三图3。
使用ProtScale软件预测Hsp40蛋白的亲疏水性，其中得分负数的区域为疏水区域，得分为正的区域为亲水性区域，Hsp40的亲疏水区域分散较开，总体呈亲水性。见封三图4。
2.2 Hsp40蛋白的三级结构
使用在线软件Swissmodel模拟Tp Hsp40蛋白的三级结构，发现其与嗜热杆菌（Thermus thermophilus）Hsp40蛋白（PDB：4j80.1）的结构最为接近，获得结构见封三图5。
2.3 Hsp40基因的克隆
以Tp DNA为模板PCR扩增Hsp40基因，然后进行电泳，DNA大小约为1150 bp左右（封三图6A）。将目的片段与pMD19-T相连，转化大肠杆菌，PCR验证阳性（封三图6B）再进行测序，测序结果证明成功克隆到Hsp40基因。
3 讨论
梅毒是由Tp感染并严重危害人类身心健康的一种性传播疾病，临床上可以分为Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期及先天梅毒等。Tp具有极强的侵袭力，进入患者体内后能够通过血液快速扩散到全身。Tp感染具有极强的隐蔽性，全球梅毒患者数量极高、传染性极强，如何有效控制和预防梅毒已成为全球普遍关注的社会和健康问题[2-4]。目前还不能够在体外培养Tp，只能够将其接种到兔子睾丸，然后增殖。目前没有办法对Tp进行基因敲除，故也无法判断那些蛋白在梅毒致病过程中发挥作用。通过体外实验证实梅毒的外膜蛋白、铁蛋白、纤连蛋白和鞭毛蛋白等能够诱导宿主细胞分泌炎症因子，推测患者感染Tp后，这些蛋白可以诱导宿主产生炎症反应，并导致宿主损伤[5-8]。寻找新的Tp毒力蛋白是目前Tp研究的热点问题，阐明这些毒力蛋白的作用机制有助于预防和控制梅毒的传播。
Hsp蛋白是一组广泛存在于真核和原核生物中受应激诱导的高度保守蛋白，它又称为伴侣蛋白。按照分子量的不同，Hsp蛋白可Hsp10，40，60或70等。Hsp40蛋白又称为DnaJ蛋白，它除了作为分子伴侣外还具有多种功能。特别是近些年发现Hsp40蛋白在先天性免疫中具有重要作用。研究已证实肺炎链球菌Hsp40蛋白可保护小鼠免受肺炎链球菌的损害[10-12]。免疫肺炎链球菌和伤寒沙门氏杆菌Hsp40蛋白后能够诱导机体产生免疫性保护功能，减轻肺炎链球菌和伤寒沙门氏杆菌的入侵[11-13]。肺炎链球菌Hsp40基因缺陷可降低肺炎感染模型小鼠的炎症反应、促炎因子分泌及胞内信号分子的激活，研究证实Hsp40蛋白能够通过TLR4受体，活化MAPK、PI3K-Akt和NF-κB等多条途径，激活DC细胞调节T细胞参与细胞免疫，接种Hsp40蛋白可以预防肺炎链球菌的感染。肺炎链球菌Hsp40蛋白能够活化巨噬细胞，从而诱导免疫应答[12-15]。
此外梅毒感染后的致病周期也较长，并且不同期的梅毒的临床症状也不一样，采取的治疗手段也有区别，目前所用的诊断方法也不能够精确判定。分期主要还是依靠患者的临床症状，目前临床患者数量多，使得在上报梅毒疫情上存在一定困难[3]，因此急需开发新的梅毒分期标志。现在采用基因工程的手段表达了Tp的抗原，这些抗原同样具有活性，并能用作临床诊断[16-17]。本文通过生物信息学方法分析了Tp Hsp40蛋白的分子量，亲疏水性和三级结构等生物学特性，同时克隆获得了Tp Hsp40基因。我们预测Tp Hsp40蛋白可能与肺炎链球菌等Hsp40蛋白具有类似功能，能够在促进分泌炎症因子中起作用，可能是Tp的一个毒力蛋白。目前还没有特异预防Tp感染的疫苗，为此我们也推测Tp Hsp40分子可能与肺炎链球菌、伤寒沙门氏杆菌等的Hsp40分子具有类似的功能，能够诱导人体对Tp产生免疫应答，从而减少Tp的感染。此外我们还打算进一步分析Hsp40蛋白在梅毒的治疗和检测方面是否具有一定的作用。 [参考文献]
[1] Radolf JD，Deka RK，Anand A，et al. Treponema pallidum，the syphilis spirochete：Making a living as a stealth pathogen[J].Nat Rev Microbiol，2016，14（12）：744-759.
[2] Pedrosa AF，Magina S，Azevedo F，et al. Re-emergence of syphilis in the biological era[J].Int J Dermatol，2016， 55（12）：e626-e628.
[3] 王千秋.中外梅毒诊疗指南介绍[J].皮肤病与性病，2016，38（3）：165-169.
[4] Yin F，Feng Z，Li X. Spatial analysis of primary and secondary syphilis incidence in China，2004-2010[J]. Int J STD AIDS，2012，23（12）：870-875.
[5] Xie Y，Xu M，Xiao Y，et al. Treponema pallidum flagellin FlaA2 induces IL-6 secretion in THP-1 cells via the Toll-like receptor 2 signaling pathway[J]. Mol Immunol，2017，81：42-51.
[6] Liu S，Wang S，Wu Y，et al. Production of proinflammatory cytokines in the human THP-1 monocyte cell line following induction by Tp0751，a recombinant protein of Treponema pallidum[J]. Sci China Life Sci，2010，53（2）：229-233.
[7] Babolin C，Amedei A，Ozolins D，et al. TpF1 from Treponema pallidum activates inflammasome and promotes the development of regulatory T cells[J]. J Immunol，2011， 187（3）：1377-1384.
[8] Pozzobon T，Facchinello N，Bossi F，et al. Treponema pallidum（syphilis） antigen TpF1 induces angiogenesis through the activation of the IL-8 pathway[J]. Sci Rep，2016，6：18785.
[9] Petrosova H，Zobanikova M，Cejkova D，et al. Whole genome sequence of Treponema pallidum ssp. pallidum，strain Mexico A，suggests recombination between yaws and syphilis strains[J].PLoS Negl Trop Dis，2012，6（9）：e1832.
[10] Cai Y，Yan W，Xu W，et al. Screening and identification of DnaJ interaction proteins in Streptococcus pneumoniae[J].Curr Microbiol，2013， 67（6）：732-741.
[11] Khan MN，Bansal A，Shukla D，et al. Immunogenicity and protective efficacy of DnaJ （hsp40） of Streptococcus pneumoniae against lethal infection in mice[J]. Vaccine，2006，24（37-39）：6225-6231.
[12] Sagi SS，Paliwal P，Bansal A，et al. Studies on immunogenicity and protective efficacy of DnaJ of Salmonella Typhi against lethal infection by Salmonella Typhimurium in mice[J].Vaccine，2006，24（49-50）：7135-7141.
[13] Liu Y，Wang H，Zhang S，et al. Mucosal immunization with recombinant fusion protein DnaJ-DeltaA146Ply enhances cross-protective immunity against Streptococcus pneumoniae infection in mice via interleukin 17A[J].Infect Immun， 2014，82（4）：1666-1675.
[14] Cui J，Ma C，Ye G，et al. DnaJ （hsp40） of Streptococcus pneumoniae is involved in bacterial virulence and elicits a strong natural immune reaction via PI3K/JNK[J].Mol Immunol，2017，83：137-146.
[15] 粟玉鳳，李达根，邢燕，等.肺炎链球菌候选蛋白疫苗DnaJ-△A146Ply通过PI3K/Akt和NF-κB信号通路刺激巨噬细胞诱导免疫应答[J].基因组学与应用生物学，2016（4）：768-774.
[16] Cameron CE，Kuroiwa JM，Yamada M，et al. Heterologous expression of the Treponema pallidum laminin-binding adhesin Tp0751 in the culturable spirochete Treponema phagedenis[J].J Bacteriol，2008，190（7）：2565-2571.
[17] Van Voorhis WC，Barrett LK，Lukehart SA，et al. Serodiagnosis of syphilis：Antibodies to recombinant Tp0453，Tp92，and Gpd proteins are sensitive and specific indicators of infection by Treponema pallidum[J].J Clin Microbiol，2003，41（8）：3668-3674.
（收稿日期：2018-01-09）
[关键词] 梅毒螺旋体；Hsp40蛋白；生物信息学；基因克隆
[中图分类号] R377 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）20-0041-03
Bioinformatical analysis and gene clone of treponema pallidum Hsp40
WU Xian HE Shuguang LIU Lingzhi CHEN Chaoying ZHU Yixi MO Zuoqun
Clinical Laboratory， First Affiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical College， Zhuzhou 412000， China
[Abstract] Objective To investigate the biological characteristics of treponema pallidum （Tp） Hsp 40 and clone its gene. Methods Protein sequence of Hsp40 was found using GenBank and its biological characteristics were analyzed using bioinformatical software. Specific primer was designed based on the genetic sequence of Tp Hsp40 and PCR was used to amplify the gene of Hsp40. The DNA fragment was ligated to pMD19-T carrier and transformed to Escherichia coli. Positive clones were selected to be verified using PCR and DNA sequencing. Results Gene of Tp Hsp40 could encode a protein of 374 amino acids. The molecular weight of the protein was 40.1 kDa. The protein had no signal peptide and was hydrophilic. The tertiary structure of Tp Hsp40 predicted by Swissmodel was closest to the structure of thermus thermophilus Hsp40. Gene of Tp Hsp40 with 1125bp amplified from genome of Tp was ligated to pMD19-T carrier. Conclusion This paper predicted the structure of Hsp40， the virulence factor of Tp， and cloned the gene of Tp Hsp40.
[Key words] Treponema pallidum； Hsp40； Bioinformatics； Gene clone
梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）是引起梅毒的病原体。研究发现Tp能够感染并破坏成人多种器官，能经胎盘传入胎儿导致先天梅毒，严重者会产生死胎和流产[1，2]。目前我国梅毒患者数量呈增加趋势，仅次于病毒性肝炎和肺结核，在法定甲乙类传染病中排第三位[3-4]。如何有效预防及控制梅毒已成为一个严重的社会问题。在Tp中未发现内毒素等传统的毒力蛋白，但是通过基因工程获得Tp鞭毛蛋白、铁蛋白TpF1、外膜蛋白和趋化蛋白在体外能够诱导细胞产生炎症反应，提示这些蛋白可能是Tp致病中的关键蛋白[5-9]。寻找Tp新的毒力蛋白是研究其致病机制的关键[9]。热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是一组具有保守结构域的蛋白超家族。在细菌受到应激和胁迫时大量表达，帮助细菌适应环境。最近发现Hsp40蛋白在细菌致病过程中可能发挥重要功能[10-13]。我们在Tp的基因组中发现了一个Hsp40同源蛋白，本实验拟采用生物信息学方法分析Hsp40蛋白的生物学特性并克隆得到Hsp40基因，为研究其功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 菌种和载体
梅毒螺旋体和大肠埃希菌Top10由湖南中医药高等专科学校附属第一医院检验科保存，克隆载体pMD19-T来自宝生物工程（大连）公司。
1.2 主要试剂
T4 DNA连接酶，高保真 DNA聚合酶，DNA marker，限制性内切酶NdeI和HindIII和DNA胶回收试剂盒从宝生物工程（大连）公司购买，细菌DNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。 1.3 Hsp40生物信息学分析
从GenBank中获取梅毒螺旋体（T.pallidum，accession number：NZ_CP003679）的Hsp40基因和蛋白序列。利用Protparam分析Hsp40蛋白的理化特性，采用ProtScale预测其亲水性，采用Swiss-model预测其三级结构。
1.4 Tp Hsp40基因的PCR扩增
依据Tp Hsp40基因序列，设计PCR引物。Hsp40-F：5’-AGCCATATGGTGGCAAAGAAGGATTATTA-3’；和Hsp40-R：5’-CCCAAGCTTCTACTTGAGACTTG-AAA-3’。然后由赛默飞世尔科技公司（广州）进行合成。以提取的梅毒螺旋体DNA为模板进行PCR扩增Hsp40基因片段。PCR体系：5 μL 10×PCR 缓冲液，1 μL引物 Hsp40-F（10 μM），1 μL引物Hsp40-R （10 μM），0.1 μg模板Tp DNA，1 μL DNA聚合酶（2.5 U/μL），1 μL dNTP Mixture（10 mM），最后加入无菌水到50 μL。PCR反应程序为：94℃ 2 min；（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）×30个循环；最后72℃ 5 min。得到的DNA片段进行电泳，然后进行回收。
1.5 pMD19-Hsp40质粒的构建与鉴定
将回收的Hsp40片段与pMD19-T载体相连，获得pMD19-Hsp40重组质粒，然后转化大肠埃希菌Top10，37℃过夜培养。挑单菌落接种到液体LB培养基进行培养，然后使用PCR鉴定，將阳性菌株进行测序。
1.6 统计学方法
SignalP4.1软件预测结果表明Hsp40蛋白无信号肽，使用ProtScale软件预测Hsp40蛋白的亲疏水性，使用在线软件Swissmodel模拟Tp Hsp40蛋白的三级结构。
2 结果
2.1 Tp Hsp40理化特性
利用Protparam分析Hsp40蛋白的理化性质，Hsp40蛋白全长含有374个氨基酸，分子量为40.1 kDa，等电点为8.75。不稳定指数为38.44，表明Hsp40蛋白不容易降解。SignalP4.1软件预测结果表明Hsp40蛋白无信号肽，定位在细菌细胞质。见封三图3。
使用ProtScale软件预测Hsp40蛋白的亲疏水性，其中得分负数的区域为疏水区域，得分为正的区域为亲水性区域，Hsp40的亲疏水区域分散较开，总体呈亲水性。见封三图4。
2.2 Hsp40蛋白的三级结构
使用在线软件Swissmodel模拟Tp Hsp40蛋白的三级结构，发现其与嗜热杆菌（Thermus thermophilus）Hsp40蛋白（PDB：4j80.1）的结构最为接近，获得结构见封三图5。
2.3 Hsp40基因的克隆
以Tp DNA为模板PCR扩增Hsp40基因，然后进行电泳，DNA大小约为1150 bp左右（封三图6A）。将目的片段与pMD19-T相连，转化大肠杆菌，PCR验证阳性（封三图6B）再进行测序，测序结果证明成功克隆到Hsp40基因。
3 讨论
梅毒是由Tp感染并严重危害人类身心健康的一种性传播疾病，临床上可以分为Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期及先天梅毒等。Tp具有极强的侵袭力，进入患者体内后能够通过血液快速扩散到全身。Tp感染具有极强的隐蔽性，全球梅毒患者数量极高、传染性极强，如何有效控制和预防梅毒已成为全球普遍关注的社会和健康问题[2-4]。目前还不能够在体外培养Tp，只能够将其接种到兔子睾丸，然后增殖。目前没有办法对Tp进行基因敲除，故也无法判断那些蛋白在梅毒致病过程中发挥作用。通过体外实验证实梅毒的外膜蛋白、铁蛋白、纤连蛋白和鞭毛蛋白等能够诱导宿主细胞分泌炎症因子，推测患者感染Tp后，这些蛋白可以诱导宿主产生炎症反应，并导致宿主损伤[5-8]。寻找新的Tp毒力蛋白是目前Tp研究的热点问题，阐明这些毒力蛋白的作用机制有助于预防和控制梅毒的传播。
Hsp蛋白是一组广泛存在于真核和原核生物中受应激诱导的高度保守蛋白，它又称为伴侣蛋白。按照分子量的不同，Hsp蛋白可Hsp10，40，60或70等。Hsp40蛋白又称为DnaJ蛋白，它除了作为分子伴侣外还具有多种功能。特别是近些年发现Hsp40蛋白在先天性免疫中具有重要作用。研究已证实肺炎链球菌Hsp40蛋白可保护小鼠免受肺炎链球菌的损害[10-12]。免疫肺炎链球菌和伤寒沙门氏杆菌Hsp40蛋白后能够诱导机体产生免疫性保护功能，减轻肺炎链球菌和伤寒沙门氏杆菌的入侵[11-13]。肺炎链球菌Hsp40基因缺陷可降低肺炎感染模型小鼠的炎症反应、促炎因子分泌及胞内信号分子的激活，研究证实Hsp40蛋白能够通过TLR4受体，活化MAPK、PI3K-Akt和NF-κB等多条途径，激活DC细胞调节T细胞参与细胞免疫，接种Hsp40蛋白可以预防肺炎链球菌的感染。肺炎链球菌Hsp40蛋白能够活化巨噬细胞，从而诱导免疫应答[12-15]。
此外梅毒感染后的致病周期也较长，并且不同期的梅毒的临床症状也不一样，采取的治疗手段也有区别，目前所用的诊断方法也不能够精确判定。分期主要还是依靠患者的临床症状，目前临床患者数量多，使得在上报梅毒疫情上存在一定困难[3]，因此急需开发新的梅毒分期标志。现在采用基因工程的手段表达了Tp的抗原，这些抗原同样具有活性，并能用作临床诊断[16-17]。本文通过生物信息学方法分析了Tp Hsp40蛋白的分子量，亲疏水性和三级结构等生物学特性，同时克隆获得了Tp Hsp40基因。我们预测Tp Hsp40蛋白可能与肺炎链球菌等Hsp40蛋白具有类似功能，能够在促进分泌炎症因子中起作用，可能是Tp的一个毒力蛋白。目前还没有特异预防Tp感染的疫苗，为此我们也推测Tp Hsp40分子可能与肺炎链球菌、伤寒沙门氏杆菌等的Hsp40分子具有类似的功能，能够诱导人体对Tp产生免疫应答，从而减少Tp的感染。此外我们还打算进一步分析Hsp40蛋白在梅毒的治疗和检测方面是否具有一定的作用。 [参考文献]
[1] Radolf JD，Deka RK，Anand A，et al. Treponema pallidum，the syphilis spirochete：Making a living as a stealth pathogen[J].Nat Rev Microbiol，2016，14（12）：744-759.
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[4] Yin F，Feng Z，Li X. Spatial analysis of primary and secondary syphilis incidence in China，2004-2010[J]. Int J STD AIDS，2012，23（12）：870-875.
[5] Xie Y，Xu M，Xiao Y，et al. Treponema pallidum flagellin FlaA2 induces IL-6 secretion in THP-1 cells via the Toll-like receptor 2 signaling pathway[J]. Mol Immunol，2017，81：42-51.
[6] Liu S，Wang S，Wu Y，et al. Production of proinflammatory cytokines in the human THP-1 monocyte cell line following induction by Tp0751，a recombinant protein of Treponema pallidum[J]. Sci China Life Sci，2010，53（2）：229-233.
[7] Babolin C，Amedei A，Ozolins D，et al. TpF1 from Treponema pallidum activates inflammasome and promotes the development of regulatory T cells[J]. J Immunol，2011， 187（3）：1377-1384.
[8] Pozzobon T，Facchinello N，Bossi F，et al. Treponema pallidum（syphilis） antigen TpF1 induces angiogenesis through the activation of the IL-8 pathway[J]. Sci Rep，2016，6：18785.
[9] Petrosova H，Zobanikova M，Cejkova D，et al. Whole genome sequence of Treponema pallidum ssp. pallidum，strain Mexico A，suggests recombination between yaws and syphilis strains[J].PLoS Negl Trop Dis，2012，6（9）：e1832.
[10] Cai Y，Yan W，Xu W，et al. Screening and identification of DnaJ interaction proteins in Streptococcus pneumoniae[J].Curr Microbiol，2013， 67（6）：732-741.
[11] Khan MN，Bansal A，Shukla D，et al. Immunogenicity and protective efficacy of DnaJ （hsp40） of Streptococcus pneumoniae against lethal infection in mice[J]. Vaccine，2006，24（37-39）：6225-6231.
[12] Sagi SS，Paliwal P，Bansal A，et al. Studies on immunogenicity and protective efficacy of DnaJ of Salmonella Typhi against lethal infection by Salmonella Typhimurium in mice[J].Vaccine，2006，24（49-50）：7135-7141.
[13] Liu Y，Wang H，Zhang S，et al. Mucosal immunization with recombinant fusion protein DnaJ-DeltaA146Ply enhances cross-protective immunity against Streptococcus pneumoniae infection in mice via interleukin 17A[J].Infect Immun， 2014，82（4）：1666-1675.
[14] Cui J，Ma C，Ye G，et al. DnaJ （hsp40） of Streptococcus pneumoniae is involved in bacterial virulence and elicits a strong natural immune reaction via PI3K/JNK[J].Mol Immunol，2017，83：137-146.
[15] 粟玉鳳，李达根，邢燕，等.肺炎链球菌候选蛋白疫苗DnaJ-△A146Ply通过PI3K/Akt和NF-κB信号通路刺激巨噬细胞诱导免疫应答[J].基因组学与应用生物学，2016（4）：768-774.
[16] Cameron CE，Kuroiwa JM，Yamada M，et al. Heterologous expression of the Treponema pallidum laminin-binding adhesin Tp0751 in the culturable spirochete Treponema phagedenis[J].J Bacteriol，2008，190（7）：2565-2571.
[17] Van Voorhis WC，Barrett LK，Lukehart SA，et al. Serodiagnosis of syphilis：Antibodies to recombinant Tp0453，Tp92，and Gpd proteins are sensitive and specific indicators of infection by Treponema pallidum[J].J Clin Microbiol，2003，41（8）：3668-3674.
（收稿日期：2018-01-09）