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摘要[目的]采用高效液相色谱法建立纵条纹炭角菌指纹图谱分析方法，比较该菌5种培养物的化学成分差异。[方法]色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18（150.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为乙腈-水梯度洗脱，检测波长210 nm，流速0.8 mL/min，温度25 ℃。测定指纹图谱后，应用相似度分析和系统聚类分析对不同培养物的化学成分进行比较。 [结果]建立了纵条纹炭角菌HPLC指纹图谱分析方法，在色谱指纹图谱中，确定了35个共有峰，根据相似度分析、系统聚类分析的结果确定棉籽壳和麸皮共培养的纵条纹炭角菌与野生条纹炭角菌化学成分最为相似。[结论]该方法简便、稳定且重现性好，可用于纵条纹炭角菌培养物的质量控制和培养方法筛选。
关键词纵条纹炭角菌；指纹图谱；HPLC；相似度分析；聚类分析
中图分类号S603.6文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）08-134-04
Abstract[Objective] To establish Xylaria striata fingerprint analysis method by High Performance Liquid Chromatography （HPLC），and to compare the differences in chemical components of five cultures.[Method] Chromatographic column was Agilent Eclipse XDB C18（150.0 mm × 4.6 mm，5.0 μm）； mobile phase was acetonitrilewater； detection wavelength was 210 nm； flow rate was 0.8 mL/min； and column temperature was 25 °C.After detecting the fingerprint，the chemical composition was compared by similarity analysis and cluster analysis.[Result] The HPLC fingerprint analysis method of X.striata was established.In chromatographic fingerprint，35 common peaks were identified.According to the results of similarity analysis and cluster analysis，the chemical compositions of X.striata cultured in cottonseed hulls and bran were most similar as the wild.[Conclusion] The method is simple，stable and repeatable，which can be used for quality control and method screening of X.striata cultures.
Key wordsXylaria striata； Fingerprint； HPLC； Similarity analysis； Cluster analysis
高等药食真菌中富含丰富的天然活性化合物，其结构新颖，药理活性强，是医药业开发的重要资源。但野生菌难于获取，需要人工培养物进行替代。两者由于生长环境不同，其内部化学物种类及含量会有较大差异，采用指纹图谱技术对比分析既可将差异定量化，又便于未来人工培养物用于医药品质量标准的建立。
纵条纹炭角菌（Xylaria striata Pat.），属子囊菌门、盘菌亚门、粪壳菌纲、炭角菌亚纲、炭角菌目、炭角菌科、炭角菌属药食真菌，原始标本采自我国南京棕榈树 Trachycarpus 老树干上[1]。现有文献已逐步报道了同属多种炭角菌具有各种活性小分子[2-7]。同属目前开发最好的是黑柄炭角菌，又名“乌灵参”，是四川、云南等地著名的补气中药，具有改善中枢神经系统、造血、抗前列腺增生以及提高机体免疫等功能[8]，已有医药产品上市销售。笔者所在课题组于2012年在四川省绵阳市发现了该种并对该菌展开系统性研究，先期完成了培养优化工作[9-11]，并在生物活性初筛时，发现该菌提取物具有抗菌[12]和抗肿瘤[13]活性。为了后续活性化合物的发现，笔者建立了纵条纹炭角菌HPLC指纹图谱分析方法，并对多种培养方式产培养物与野生菌化学成分进行比较，以便于后期的开发利用。
1材料与方法
1.1仪器1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），Acculab Alc电子天平（德国赛多利斯科技仪器有限公司），R100旋转蒸发仪（瑞士步琪公司），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2试药麦角甾醇对照品（纯度97.0%），云南西力生物技术股份有限公司；高效液相色谱用乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；超纯水（18.2 ΩPa）为西南科技大学制药工艺学实验室自制，其他试剂均为国产分析纯。
1.3样品人工培养纵条纹炭角菌样品5份，野生纵条纹炭角菌样品1份（经贺新生教授鉴定为Xylaria striata Pat.1887），样品编号、名称、部位和培养方式见表1。所有子实体样品除杂风干并经50 ℃烘干，菌丝体经纱布过滤纯水洗涤后经50 ℃烘干。所有样品经小型中药粉碎机粉碎后过30目筛避光保存备用。
1.4方法
1.4.1对照品溶液的制备。 精密称取麦角甾醇对照品5.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容即得对照品溶液（0.5 mg/mL），置于4 ℃避光保存备用。
1.4.2供试品溶液的制备。
精密称取各样品粉末0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称重，超声（功率300 W，频率40 kHz）处理20 min，冷却至室温，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液（0.025 g/mL），置于4 ℃避光保存备用。
1.4.3色谱条件。Agilent Eclipse XDB C18色谱柱（150.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为乙腈（A）：水（B）梯度洗脱（0～50 min，5%～100%A；50～60 min，100%A），再次进样前平衡时间30 min，流速0.8 mL/min，检测波长210 nm，进样量5 μL，温度25 ℃。
2结果与分析
2.1指纹图谱方法学考察
2.1.1精密度。
取野生纵条纹炭角菌子实体样品（S3）适量，按“1.4.2”方法制备样品，连续进样6针，考察各针中各个共有峰相对保留时间及相对峰面积的一致性。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004A版）对所得的色谱图进行评价，所有色谱图的相似度值不低于0.900，从自动匹配后的共有峰中选择面积较大的21个峰，以19号峰为参照峰S，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰与参照峰相对保留时间的RSD均小于0.5%，相对峰面积的RSD均小于2.91%，表明仪器精密度较好，符合指纹图谱要求。
2.1.2重复性。
取野生纵条纹炭角菌子实体样品（S3）适量，按“1.4.2”方法制备样品，分别取6份供试品溶液进样测定。以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004A版）评价，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.5%～0.7%，相对峰面积的RSD为1.5%～2.9% ，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。
2.1.3稳定性。
取野生纵条纹炭角菌子实体样品（S3）适量，按“1.4.2”方法制备样品，分别在 0、2、4、6、8、10 h进样，检测指纹图谱。以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（ 2004A版） 评价，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.3%～0.4%，相对峰面积的RSD为1.2%～2.1%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。
2.2不同培养方式下样品指纹图谱的建立及分析
分别将6种样品按“1.4.2”方法制备后，在“1.4.3”色谱条件下测定，记录色谱图（图3）。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（ 2004A 版） 对样品的图谱数据进行分析，确定35个色谱峰为其特征峰。经对照品确定，32号峰为麦角甾醇，其保留时间适中，峰面积较大且稳定，峰形较好，各样品中均具有一定含量，故选择其为内参照峰，将其保留时间和色谱峰面积设为1，将其他特征峰的保留时间与峰面积和参照峰的保留时间与峰面积相比，得到各峰的相对保留时间和相对峰面积（表2）。按以上方法计算各样品35个共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果差异明显。
2.3指纹图谱相似度评价
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004A版）对6种样品分别进行相似度评价，设定S3为参照图谱，中位数法，时间窗口宽度0.1，将其样品的色谱图与参照图进行自动匹配，建立共有模式，计算其他条件培养的条纹炭角菌与野生条纹炭角菌的相似度（表3）。由表3可知，S3和S4最相似，即棉籽壳和麸皮共培养的条纹炭角菌子实体与野生条纹炭角菌子实体最相似，其次依次是S1、S2、S5、S6。
2.4样品的聚类分析将6种样品HPLC图谱中35个共有峰的相对保留时间运用SPSS19.0软件对其进行分析，采用最近邻元素法，利用平方欧式距离作为样品的测度。由图4可知，S3和S1、S2、S4聚为第I类，该结果与指纹图谱相似度分析结果相似。
3结论与讨论
该试验利用DAD检测器同时考察了多个检测波长（210、220、240、254、280、300、320和360 nm）的指纹图谱，结果表明在210 nm下的色谱信号多，峰形好。同时考察了60 min以上梯度洗脱效果，结果表明60 min即可将重叠的图谱峰分离开，耗时较少，提高了检测效率。
该试验建立了条纹炭角菌的HPLC指纹图谱，该方法简便易行，所检测到的化学成分均得到较好的分离。指纹图谱相似度和聚类分析均说明不同培养条件下条纹炭角菌的成分与野生条纹炭角菌的成分差异较大，其中棉籽壳和麸皮共培养的条纹炭角菌与野生条纹炭角菌成分最为相似，可用于后续该菌化学成分研究的材料，为今后有效成分提取纯化的材料选择提供依据。
野生食药用真菌自然生长条件下产量很低，无法满足食品药品的后续开发使用。人工培养是解决产量的最佳方法，但不同培养方式因其培养基、培养方式的不同，培养物的化学成分和野生种类差异可能很大。该试验通过指纹图谱优选的方式，可以更好地优选接近野生品种的培养方式，为一种野生食药用真菌开发的优良方法。
参考文献
[1]
贺新生.四川盆地蕈菌图志[M].北京：科学出版社，2011：52-57.
[2] 吴根福.黑柄炭角菌产生的DPPH自由基捕捉成分[J].微生物学报，2001，41（3）：363-366.
[3] 龚庆芳，武守华，谭宁华，等.黑柄炭角菌发酵菌丝中抗氧化及抗肿瘤活性的有效成分研究[J].食品科技，2008，33（12）：28-31.
[4] 龚庆芳，张玉梅，谭宁华，等.黑柄炭角菌发酵菌丝体的化学成分研究[J].中国中药杂志，2008，33（11）：1269-1272.
[5] 麻兵继，阮元，刘吉开，等.长柄炭角菌子实体化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2008，20（1）：63-65.
[6] 杨小龙，刘吉开，罗都强，等.黑柄炭角菌的化学成分[J].天然产物研究与开发，2011，23（5）：846-849.
[7] 王兴娜，黄午阳，刘吉开，等.大炭角菌子实体化学成分的研究[J].中草药，2012，43（12）：2327-2332.
[8] 马橙，翁榕安，张平，等.黑柄炭角菌的研究进展[J].菌物研究，2009，7（1）：59-62.
[9] 马贝贝，霍存录，贺新生，等.纵条纹炭角菌子实体培养[J].食品与发酵科技，2013，49（2）：44-47.
[10] 冯望，吴颖，尤雅，等.纵条纹炭角菌培养条件的优化[J].广东农业科学，2014（10）：90-94.
[11] 刘霞，高聪，钟雨婷，等.纵条纹炭角菌菌丝体液体培养条件的优化[J].中药材，2014，37（8）：1317-1321.
[12] 袁小红，张春杰，刘霞，等.6种高等真菌醇提物对植物病原菌的抗菌活性研究[J].安徽农业科学，2013，41（12） ：5289-5290，5294.
[13] 袁小红，张春杰，郑仁林，等.六种高等真菌醇提物的抗肿瘤活性筛选[J].西南科技大学学报，2013，28（3）：95-97.
关键词纵条纹炭角菌；指纹图谱；HPLC；相似度分析；聚类分析
中图分类号S603.6文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）08-134-04
Abstract[Objective] To establish Xylaria striata fingerprint analysis method by High Performance Liquid Chromatography （HPLC），and to compare the differences in chemical components of five cultures.[Method] Chromatographic column was Agilent Eclipse XDB C18（150.0 mm × 4.6 mm，5.0 μm）； mobile phase was acetonitrilewater； detection wavelength was 210 nm； flow rate was 0.8 mL/min； and column temperature was 25 °C.After detecting the fingerprint，the chemical composition was compared by similarity analysis and cluster analysis.[Result] The HPLC fingerprint analysis method of X.striata was established.In chromatographic fingerprint，35 common peaks were identified.According to the results of similarity analysis and cluster analysis，the chemical compositions of X.striata cultured in cottonseed hulls and bran were most similar as the wild.[Conclusion] The method is simple，stable and repeatable，which can be used for quality control and method screening of X.striata cultures.
Key wordsXylaria striata； Fingerprint； HPLC； Similarity analysis； Cluster analysis
高等药食真菌中富含丰富的天然活性化合物，其结构新颖，药理活性强，是医药业开发的重要资源。但野生菌难于获取，需要人工培养物进行替代。两者由于生长环境不同，其内部化学物种类及含量会有较大差异，采用指纹图谱技术对比分析既可将差异定量化，又便于未来人工培养物用于医药品质量标准的建立。
纵条纹炭角菌（Xylaria striata Pat.），属子囊菌门、盘菌亚门、粪壳菌纲、炭角菌亚纲、炭角菌目、炭角菌科、炭角菌属药食真菌，原始标本采自我国南京棕榈树 Trachycarpus 老树干上[1]。现有文献已逐步报道了同属多种炭角菌具有各种活性小分子[2-7]。同属目前开发最好的是黑柄炭角菌，又名“乌灵参”，是四川、云南等地著名的补气中药，具有改善中枢神经系统、造血、抗前列腺增生以及提高机体免疫等功能[8]，已有医药产品上市销售。笔者所在课题组于2012年在四川省绵阳市发现了该种并对该菌展开系统性研究，先期完成了培养优化工作[9-11]，并在生物活性初筛时，发现该菌提取物具有抗菌[12]和抗肿瘤[13]活性。为了后续活性化合物的发现，笔者建立了纵条纹炭角菌HPLC指纹图谱分析方法，并对多种培养方式产培养物与野生菌化学成分进行比较，以便于后期的开发利用。
1材料与方法
1.1仪器1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），Acculab Alc电子天平（德国赛多利斯科技仪器有限公司），R100旋转蒸发仪（瑞士步琪公司），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2试药麦角甾醇对照品（纯度97.0%），云南西力生物技术股份有限公司；高效液相色谱用乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；超纯水（18.2 ΩPa）为西南科技大学制药工艺学实验室自制，其他试剂均为国产分析纯。
1.3样品人工培养纵条纹炭角菌样品5份，野生纵条纹炭角菌样品1份（经贺新生教授鉴定为Xylaria striata Pat.1887），样品编号、名称、部位和培养方式见表1。所有子实体样品除杂风干并经50 ℃烘干，菌丝体经纱布过滤纯水洗涤后经50 ℃烘干。所有样品经小型中药粉碎机粉碎后过30目筛避光保存备用。
1.4方法
1.4.1对照品溶液的制备。 精密称取麦角甾醇对照品5.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容即得对照品溶液（0.5 mg/mL），置于4 ℃避光保存备用。
1.4.2供试品溶液的制备。
精密称取各样品粉末0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称重，超声（功率300 W，频率40 kHz）处理20 min，冷却至室温，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液即得供试品溶液（0.025 g/mL），置于4 ℃避光保存备用。
1.4.3色谱条件。Agilent Eclipse XDB C18色谱柱（150.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为乙腈（A）：水（B）梯度洗脱（0～50 min，5%～100%A；50～60 min，100%A），再次进样前平衡时间30 min，流速0.8 mL/min，检测波长210 nm，进样量5 μL，温度25 ℃。
2结果与分析
2.1指纹图谱方法学考察
2.1.1精密度。
取野生纵条纹炭角菌子实体样品（S3）适量，按“1.4.2”方法制备样品，连续进样6针，考察各针中各个共有峰相对保留时间及相对峰面积的一致性。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004A版）对所得的色谱图进行评价，所有色谱图的相似度值不低于0.900，从自动匹配后的共有峰中选择面积较大的21个峰，以19号峰为参照峰S，考察共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰与参照峰相对保留时间的RSD均小于0.5%，相对峰面积的RSD均小于2.91%，表明仪器精密度较好，符合指纹图谱要求。
2.1.2重复性。
取野生纵条纹炭角菌子实体样品（S3）适量，按“1.4.2”方法制备样品，分别取6份供试品溶液进样测定。以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004A版）评价，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.5%～0.7%，相对峰面积的RSD为1.5%～2.9% ，表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。
2.1.3稳定性。
取野生纵条纹炭角菌子实体样品（S3）适量，按“1.4.2”方法制备样品，分别在 0、2、4、6、8、10 h进样，检测指纹图谱。以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（ 2004A版） 评价，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.3%～0.4%，相对峰面积的RSD为1.2%～2.1%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。
2.2不同培养方式下样品指纹图谱的建立及分析
分别将6种样品按“1.4.2”方法制备后，在“1.4.3”色谱条件下测定，记录色谱图（图3）。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（ 2004A 版） 对样品的图谱数据进行分析，确定35个色谱峰为其特征峰。经对照品确定，32号峰为麦角甾醇，其保留时间适中，峰面积较大且稳定，峰形较好，各样品中均具有一定含量，故选择其为内参照峰，将其保留时间和色谱峰面积设为1，将其他特征峰的保留时间与峰面积和参照峰的保留时间与峰面积相比，得到各峰的相对保留时间和相对峰面积（表2）。按以上方法计算各样品35个共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果差异明显。
2.3指纹图谱相似度评价
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2004A版）对6种样品分别进行相似度评价，设定S3为参照图谱，中位数法，时间窗口宽度0.1，将其样品的色谱图与参照图进行自动匹配，建立共有模式，计算其他条件培养的条纹炭角菌与野生条纹炭角菌的相似度（表3）。由表3可知，S3和S4最相似，即棉籽壳和麸皮共培养的条纹炭角菌子实体与野生条纹炭角菌子实体最相似，其次依次是S1、S2、S5、S6。
2.4样品的聚类分析将6种样品HPLC图谱中35个共有峰的相对保留时间运用SPSS19.0软件对其进行分析，采用最近邻元素法，利用平方欧式距离作为样品的测度。由图4可知，S3和S1、S2、S4聚为第I类，该结果与指纹图谱相似度分析结果相似。
3结论与讨论
该试验利用DAD检测器同时考察了多个检测波长（210、220、240、254、280、300、320和360 nm）的指纹图谱，结果表明在210 nm下的色谱信号多，峰形好。同时考察了60 min以上梯度洗脱效果，结果表明60 min即可将重叠的图谱峰分离开，耗时较少，提高了检测效率。
该试验建立了条纹炭角菌的HPLC指纹图谱，该方法简便易行，所检测到的化学成分均得到较好的分离。指纹图谱相似度和聚类分析均说明不同培养条件下条纹炭角菌的成分与野生条纹炭角菌的成分差异较大，其中棉籽壳和麸皮共培养的条纹炭角菌与野生条纹炭角菌成分最为相似，可用于后续该菌化学成分研究的材料，为今后有效成分提取纯化的材料选择提供依据。
野生食药用真菌自然生长条件下产量很低，无法满足食品药品的后续开发使用。人工培养是解决产量的最佳方法，但不同培养方式因其培养基、培养方式的不同，培养物的化学成分和野生种类差异可能很大。该试验通过指纹图谱优选的方式，可以更好地优选接近野生品种的培养方式，为一种野生食药用真菌开发的优良方法。
参考文献
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[4] 龚庆芳，张玉梅，谭宁华，等.黑柄炭角菌发酵菌丝体的化学成分研究[J].中国中药杂志，2008，33（11）：1269-1272.
[5] 麻兵继，阮元，刘吉开，等.长柄炭角菌子实体化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2008，20（1）：63-65.
[6] 杨小龙，刘吉开，罗都强，等.黑柄炭角菌的化学成分[J].天然产物研究与开发，2011，23（5）：846-849.
[7] 王兴娜，黄午阳，刘吉开，等.大炭角菌子实体化学成分的研究[J].中草药，2012，43（12）：2327-2332.
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[9] 马贝贝，霍存录，贺新生，等.纵条纹炭角菌子实体培养[J].食品与发酵科技，2013，49（2）：44-47.
[10] 冯望，吴颖，尤雅，等.纵条纹炭角菌培养条件的优化[J].广东农业科学，2014（10）：90-94.
[11] 刘霞，高聪，钟雨婷，等.纵条纹炭角菌菌丝体液体培养条件的优化[J].中药材，2014，37（8）：1317-1321.
[12] 袁小红，张春杰，刘霞，等.6种高等真菌醇提物对植物病原菌的抗菌活性研究[J].安徽农业科学，2013，41（12） ：5289-5290，5294.
[13] 袁小红，张春杰，郑仁林，等.六种高等真菌醇提物的抗肿瘤活性筛选[J].西南科技大学学报，2013，28（3）：95-97.