探讨实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)在白色念珠菌检测中的初步应用效果。

(1)取1 mL白色念珠菌标准株及阴性对照菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、光滑念珠菌标准株菌液，使用酵母/细菌基因组试剂盒提取DNA。分析PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠菌的特异性。(2)取1株白色念珠菌标准株，以光滑念珠菌为阴性对照菌，复苏摇菌并计数，10倍倍比稀释为1×10⁷ ～1×10¹集落形成单位(CFU)/mL，同实验(1)提取DNA，分析PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠球菌的灵敏性。统计实时荧光定量PCR扩增曲线达到阈值所需循环数及实时荧光RPA出现特异性扩增曲线所需时间，并与PCR结果进行比对。统计3种方法对白色念珠菌的检出下限及检出率，分析实时荧光RPA中白色念珠菌浓度与检测时间之间的相关性。(3)取1株白色念珠菌标准株，同实验(1)提取DNA，分别行PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA，统计3种方法检测总时长。(4)取31份疑似感染白色念珠菌的临床样本和1份棉拭子取材的白色念珠菌临床样本提取DNA，进行PCR与实时荧光RPA，统计阳性检出率。分别采用酵母/细菌基因组试剂盒、chelex－100加热煮沸法、液氮反复冻融法提取上述2种方法检测均出现阳性结果的临床样本的DNA。同前行实时荧光RPA检测(以光滑念珠菌为阴性对照菌)和PCR检测，阴性对照菌同实验(1)，观察2种方法检测是否出现阳性结果，并统计实时荧光RPA中扩增曲线达到荧光阈值所需时间。对数据行线性相关分析和t检验。

(1)3种方法检测中白色念珠菌均出现阳性结果，5种阴性对照菌均未出现阳性结果。(2)白色念珠菌菌液浓度越低，实时荧光定量PCR中扩增曲线达到阈值所需循环数越多，实时荧光RPA中出现特异性扩增曲线所需时间越长，PCR中凝胶条带的亮度越弱，3种检测方法中阴性对照菌均未出现相应的阳性结果。实时荧光RPA、PCR与实时荧光定量PCR中白色念珠菌的检出下限均为1×10¹ CFU/mL。实时荧光RPA中白色念珠菌浓度与检测时间呈明显负相关，r＝－0.95，P<0.01。PCR与实时荧光定量PCR对1×10¹～1×10⁷ CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率均为100%。实时荧光RPA对1×10¹ CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率为78%，对1×10² ～1×10⁷ CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率均为100%。(3)PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠菌的总时间分别为133、93、35 min。(4)实时荧光RPA对31份疑似感染白色念珠菌临床样本的阳性检出率为32.26%(10/31)，低于PCR的35.48%(11/31)。11份临床样本经实时荧光RPA与PCR检测均出现阳性结果，阴性对照菌均未出现阳性结果。采用酵母/细菌基因组提取试剂盒、chelex－100加热煮沸法提取DNA进行实时荧光RPA，扩增曲线达到阈值所需时间分别为(438±13)、(462±12)s，二者相近(t＝1.32，P>0.05)。液氮反复冻融法提取DNA进行实时荧光RPA，扩增曲线达到阈值所需时间为(584±15)s，明显长于另外2种方法(t＝7.55、6.39，P<0.01)。

实时荧光RPA检测白色念珠菌具有检测快速、操作简单、灵敏性高、特异性好等优点，值得临床推广应用。