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【中图分类号】R739.6【文献标识码】A【文章编号】1550-1868（2014）11
【摘要】目的 为了检测粘蛋白1（Mucin1，Muc1）与β-连蛋白（β-catenin）在喉鳞状细胞癌中的表达，并探讨其在喉癌发病机制中的意义。方法 应用免疫组化sp 法检测54例患有喉鳞状细胞癌患者的癌组织以及自身癌旁正常组织，并应用相同的检测方法来检测37例患有喉良性肿瘤患者中MuC1与β-catenin 基因的表达情况，并进一步将二者表达情况进行统计分析。结果 MuC1和β-catenin 二者在喉鳞状细胞癌中表达率分别为44. 4%与64. 8%，与自身癌旁正常组织和喉良性肿瘤表达率相比较，均有统计学意义（P<0.05）；（2） Mucl与β-catenin基因的表达成正相关，r=0. 62， P < 0.001。结论 Mucl与β-catenin 基因在喉鳞癌细胞中均高表达，且呈正相关，提示其对喉癌发生与发展可能具有一定的促进作用。
【关键词】粘蛋白1；β-连蛋白；喉鳞状细胞癌
喉鳞状细胞癌是发生在头颈部常见的原发性恶性肿瘤，现在由于各种因素的影响，其发病率均有升高[1]。喉鳞状细胞癌侵袭与转移是造成其预后差的最重要原因，那么，研究其侵袭转移的作用机制显得尤为重要。Wnt/β-catenin 信号通路是侵袭转移机制的经典研究方法，而β-连蛋自是Wnt/β-catenin的关键蛋白[2]。β-连蛋白（β-catenin）是连蛋白的一种亚型，也参与细胞粘附作用。当β-catenin 达到一定浓度时，开启wnt/β-catenin信号通路，激活下游癌基因过度表达，就会导致肿瘤的发生[3]。粘蛋白1（Mucin1，Muc1）在正常情况下，在腺上皮近管腔面的顶端表达，肿瘤细胞中其表达发生变化，使粘附作用减弱，促进癌细胞转移[4-5]。本文通过检测Muc1与β-catenin 基因在喉鳞状细胞癌中的表达，探讨其对喉癌发病机制中的意义。
1 材料与方法
1.1 材料收集2010-2014年宁夏医科大学总院手术切除的喉鳞状细胞癌组织 （术前均未进行过任何化疗、放疗，术中病理诊断为喉鳞状细胞癌）标本共54例，同时取癌旁正常组织进行对照。另取同时期同年龄段、经术中病理诊断为喉部良性肿瘤标本37例患者。
1.2 方法 应用免疫组化SP法检测Muc1、β-catenin基因的表达情况，并进一步将二者表达情况进行统计分析。
1.3 步骤将新鲜的组织标本立即经10%甲醛固定、常规脱水后石蜡包埋、进行切片。将石蜡包埋的组织切片在65-68℃烤箱内进行烘干，3小时后取出。将组织切片放入二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3中各脱蜡10分钟，再放入100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中进行梯度水化，纯水中漂去酒精，用PBS液冲洗3次，每次3分钟，进行热修复，放入3%H2O210分钟，用PBS液冲洗3次，每次3分钟，加入蛋白阻断剂后，进行一抗孵育，4℃冰箱过夜。第二天在37℃烤箱内复温1小时，用PBS液冲洗3次，每次3分钟，加入山羊血清后再用PBS液冲洗，加入二抗30分钟，PBS液冲洗后加入DAB显色剂，显微镜下观察显色后放入纯水中，放入苏木精染缸中染色，纯水中清洗，封闭液封闭后用中性树胶封片，自然风干后贴上标签。
1.4 染色结果阳性判断依据 β-catenin免疫组化的染色结果参照Maruyama法，若其在细胞膜的阳性细胞率大于70%为正常表达；细胞浆或细胞核阳性细胞率大于10%为异常表达[5]。Muc1的阳性表达为导管及腺泡上皮的近管腔侧胞膜或胞质内胞膜棕黄色颗粒沉积，阳性细胞率在5-50%为阳性。
1.5 统计学分析采用SPSS17.0统计学软件对喉癌与癌旁正常组织、喉癌与喉良性肿瘤的β-catenin与Mucl阳性细胞率进行卡方检验，P < 0. 05 为差异有统计学意义，用直线回归方程分析二者在喉鳞状细胞癌中的关联性。
2 结果
2.1 β-catenin基因的阳性表达率β-catenin在细胞质或细胞核上异位表达，其表达率为64.8%，显著高于癌旁正常组织与喉部良性肿瘤中组织中二者的表达（P<0.001，p=0.025）。（见表1）
2.2 MuC1的阳性表达率 Muc1在细胞质或细胞核上异位表达，其表达率为44.4%，显著高于癌旁正常组织与喉部良性肿瘤组织中二者的表达（ P<0.001，p=0.025），喉鳞癌细胞中β-catenin与Muc1表达呈明显正相关（r=0. 62， P< 0.01）。（见表2）
3 讨论
β-连蛋白位于胞膜，介导细胞间粘附与参与基因表达，参与Wnt/β-catenin通路的关键蛋白，调控细胞的分化，凋亡与侵袭转移[10]。β-catenin基因位于人染色体3p21，对Wnt经典信号通路具有重要研究意义[11]。正常细胞Wnt通路处于关闭状态，β-catenin在细胞膜，少量在细胞浆中表达。当肿瘤细胞中β-catenin在胞浆大量堆积，达到一定浓度开启Wntβ-catenin通路，将下游的癌基因激活而发挥作用[12]。
粘蛋白1是分泌型上皮合成的高分子量糖蛋白，在正常细胞起粘附与润滑作用。在上皮性肿瘤中，粘蛋白1表达增高会改变细胞间粘附作用，易于肿瘤细胞的转移。本次研究发现，喉鳞状细胞癌组织中MUC1阳性表达主要位于胞膜或胞质，且在喉鳞状细胞癌组织中MUC1呈高表达，阳性率为44.4%。对比癌旁正常组织与喉部良性肿瘤MUC1表达弱或不表达。MUC1在喉鱗状细胞癌组织中高表达与癌旁正常组织与喉部良性肿瘤低表达差异显著，具有统计学意义（P<0.05）。而文献未搜索到MUC1在喉鳞状细胞癌组织的表达情况。本次研究还发现粘蛋白1与β-连蛋白二者呈正相关，而已有文献仅在乳腺癌、宫颈癌报道，喉癌研究方面未见报道，为进一步研究喉鳞状细胞癌发生发展的作用机制提供新思路。 参考文献
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[2]Howe LR， Brow n AM. Wnt signaling and breast cancer[J]. Cancer Biol Ther， 2004， 3（1）： 36- 41·
[3]韩安家，熊敏，李智等. 上皮钙依赖黏附素相关分子在乳腺浸润性小叶癌和导管癌中的表达及意义[J]，中华病理学杂志，2001， 30 （1）： 27-30·
[4]张立新，李春海，MUC1粘蛋白的免疫生物学作用及其在腫瘤生物治疗中的应用[J]·中国肿瘤生物治疗杂志，2000. 7 （3）：165-170.
[5]陶德定，江敏，吴剑宏等. 固定后乳腺癌细胞株雌激素和孕激素受体的Western blot 检测[J].癌症，2004， 23（3）：339- 341.
[6]Dekker J ， Rossen JW， Buller HA ， et all The MUC family an obituary [J]. Trends Biochem Sci，2002 ，27：1261.
[7]Taylor-Papadimitriou J .Burchell J Miles DW， et all MUC1 and cancer[J].Biochim Biophys Acta ，1999 ，1455：3011.
[8]Swallow DM， Gendler S .Griffiths B ， et al. The human tumor-associated epithelial mucins are coded by an expressed hypervariable gene locus PUM[J]1 Nature1987 328：821
[9]Spice AP，Parry G， Patton S ， et al. Molecular cloning and analysis of the mouse homologue of the tumour-associated mucin ，MUC1 ， reveals conservation of potential O-glycosylation tites ，transmembrane ， and cytoplasmic domains and a loss of minIsatellite-like polymorphism[J]， J BIol Chem ，1991，266：150991.
[10]Turashvili G， Boucha J， Burkadze G， et al. Wnt signaling pathway in mammary gland development and carcinogenesi[J]. Pathobiology， 2006， 73 （5）：213- 223.
[11]崔健. Wnt 通足与肿瘤[J].国外医学：肿瘤学分册， 2000，27 （3）：138-140.
[12]Musgrove E A. Wnt signaling via the epidermal growth factor receptor： a role in breast cancer [J]. Breast Cancer Res， 2004， 6 （2）： 65-68
【摘要】目的 为了检测粘蛋白1（Mucin1，Muc1）与β-连蛋白（β-catenin）在喉鳞状细胞癌中的表达，并探讨其在喉癌发病机制中的意义。方法 应用免疫组化sp 法检测54例患有喉鳞状细胞癌患者的癌组织以及自身癌旁正常组织，并应用相同的检测方法来检测37例患有喉良性肿瘤患者中MuC1与β-catenin 基因的表达情况，并进一步将二者表达情况进行统计分析。结果 MuC1和β-catenin 二者在喉鳞状细胞癌中表达率分别为44. 4%与64. 8%，与自身癌旁正常组织和喉良性肿瘤表达率相比较，均有统计学意义（P<0.05）；（2） Mucl与β-catenin基因的表达成正相关，r=0. 62， P < 0.001。结论 Mucl与β-catenin 基因在喉鳞癌细胞中均高表达，且呈正相关，提示其对喉癌发生与发展可能具有一定的促进作用。
【关键词】粘蛋白1；β-连蛋白；喉鳞状细胞癌
喉鳞状细胞癌是发生在头颈部常见的原发性恶性肿瘤，现在由于各种因素的影响，其发病率均有升高[1]。喉鳞状细胞癌侵袭与转移是造成其预后差的最重要原因，那么，研究其侵袭转移的作用机制显得尤为重要。Wnt/β-catenin 信号通路是侵袭转移机制的经典研究方法，而β-连蛋自是Wnt/β-catenin的关键蛋白[2]。β-连蛋白（β-catenin）是连蛋白的一种亚型，也参与细胞粘附作用。当β-catenin 达到一定浓度时，开启wnt/β-catenin信号通路，激活下游癌基因过度表达，就会导致肿瘤的发生[3]。粘蛋白1（Mucin1，Muc1）在正常情况下，在腺上皮近管腔面的顶端表达，肿瘤细胞中其表达发生变化，使粘附作用减弱，促进癌细胞转移[4-5]。本文通过检测Muc1与β-catenin 基因在喉鳞状细胞癌中的表达，探讨其对喉癌发病机制中的意义。
1 材料与方法
1.1 材料收集2010-2014年宁夏医科大学总院手术切除的喉鳞状细胞癌组织 （术前均未进行过任何化疗、放疗，术中病理诊断为喉鳞状细胞癌）标本共54例，同时取癌旁正常组织进行对照。另取同时期同年龄段、经术中病理诊断为喉部良性肿瘤标本37例患者。
1.2 方法 应用免疫组化SP法检测Muc1、β-catenin基因的表达情况，并进一步将二者表达情况进行统计分析。
1.3 步骤将新鲜的组织标本立即经10%甲醛固定、常规脱水后石蜡包埋、进行切片。将石蜡包埋的组织切片在65-68℃烤箱内进行烘干，3小时后取出。将组织切片放入二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3中各脱蜡10分钟，再放入100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中进行梯度水化，纯水中漂去酒精，用PBS液冲洗3次，每次3分钟，进行热修复，放入3%H2O210分钟，用PBS液冲洗3次，每次3分钟，加入蛋白阻断剂后，进行一抗孵育，4℃冰箱过夜。第二天在37℃烤箱内复温1小时，用PBS液冲洗3次，每次3分钟，加入山羊血清后再用PBS液冲洗，加入二抗30分钟，PBS液冲洗后加入DAB显色剂，显微镜下观察显色后放入纯水中，放入苏木精染缸中染色，纯水中清洗，封闭液封闭后用中性树胶封片，自然风干后贴上标签。
1.4 染色结果阳性判断依据 β-catenin免疫组化的染色结果参照Maruyama法，若其在细胞膜的阳性细胞率大于70%为正常表达；细胞浆或细胞核阳性细胞率大于10%为异常表达[5]。Muc1的阳性表达为导管及腺泡上皮的近管腔侧胞膜或胞质内胞膜棕黄色颗粒沉积，阳性细胞率在5-50%为阳性。
1.5 统计学分析采用SPSS17.0统计学软件对喉癌与癌旁正常组织、喉癌与喉良性肿瘤的β-catenin与Mucl阳性细胞率进行卡方检验，P < 0. 05 为差异有统计学意义，用直线回归方程分析二者在喉鳞状细胞癌中的关联性。
2 结果
2.1 β-catenin基因的阳性表达率β-catenin在细胞质或细胞核上异位表达，其表达率为64.8%，显著高于癌旁正常组织与喉部良性肿瘤中组织中二者的表达（P<0.001，p=0.025）。（见表1）
2.2 MuC1的阳性表达率 Muc1在细胞质或细胞核上异位表达，其表达率为44.4%，显著高于癌旁正常组织与喉部良性肿瘤组织中二者的表达（ P<0.001，p=0.025），喉鳞癌细胞中β-catenin与Muc1表达呈明显正相关（r=0. 62， P< 0.01）。（见表2）
3 讨论
β-连蛋白位于胞膜，介导细胞间粘附与参与基因表达，参与Wnt/β-catenin通路的关键蛋白，调控细胞的分化，凋亡与侵袭转移[10]。β-catenin基因位于人染色体3p21，对Wnt经典信号通路具有重要研究意义[11]。正常细胞Wnt通路处于关闭状态，β-catenin在细胞膜，少量在细胞浆中表达。当肿瘤细胞中β-catenin在胞浆大量堆积，达到一定浓度开启Wntβ-catenin通路，将下游的癌基因激活而发挥作用[12]。
粘蛋白1是分泌型上皮合成的高分子量糖蛋白，在正常细胞起粘附与润滑作用。在上皮性肿瘤中，粘蛋白1表达增高会改变细胞间粘附作用，易于肿瘤细胞的转移。本次研究发现，喉鳞状细胞癌组织中MUC1阳性表达主要位于胞膜或胞质，且在喉鳞状细胞癌组织中MUC1呈高表达，阳性率为44.4%。对比癌旁正常组织与喉部良性肿瘤MUC1表达弱或不表达。MUC1在喉鱗状细胞癌组织中高表达与癌旁正常组织与喉部良性肿瘤低表达差异显著，具有统计学意义（P<0.05）。而文献未搜索到MUC1在喉鳞状细胞癌组织的表达情况。本次研究还发现粘蛋白1与β-连蛋白二者呈正相关，而已有文献仅在乳腺癌、宫颈癌报道，喉癌研究方面未见报道，为进一步研究喉鳞状细胞癌发生发展的作用机制提供新思路。 参考文献
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[4]张立新，李春海，MUC1粘蛋白的免疫生物学作用及其在腫瘤生物治疗中的应用[J]·中国肿瘤生物治疗杂志，2000. 7 （3）：165-170.
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