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长江中游水文水资源勘测局益阳分局； 4长江水利委员会水文局）
摘要 以UV-HPLC为监测手段，建立了氯苯的高效液相色谱分析法，系统地研究了波长、流动相配比、柱温以及流速和响应值之间的关系。该方法分析时间短、准确度高、稳定性好、操作简单、数据重复性好，已成功地应用于水利部能力验证考核样比测和地表水监测中。
关键词 UV-HPLC；氯苯；地表水监测；精确分析中图分类号 O657.7 2；X832 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0158-02
氯苯类化合物是化学性质较稳定的一类有机污染物，不易分解，对环境和人体有极大危害。氯苯类化合物是我国环境监测优先控制污染物，其检测有重要意义[1-3]。因为氯苯挥发性强，在水中溶解度小，EPA和国标中对氯苯的测试分别采用气相色谱质谱联用仪GC-MS和气相色谱法ECD-GC或FID-GC。但质谱仪MS价格昂贵，一般实验室配置率不高；ECD-GC则因为氯苯中氯的质量占31.6%，比例比较低，其响应值明显弱于其他同系物，在低浓度时常常检测不到信号，适用性较差。因此，氯苯多采用FID-GC[4-9]，行业标准为《水质 氯苯的测定 气相色谱法》（HJ T74—2001）[10]。该标准使用较为落后的填充柱分离手段，不能适应现阶段发展的需要，在实际工作中，常常用毛细管柱替换，但由于氯苯出峰时间较早，如果试验条件设置不当，则不容易与溶剂峰相分离，甚至会出现在较高浓度下检测不到氯苯信号峰的情况，给实际监测工作带来影响[11-15]。因此，如何建立一种灵敏、快速、经济、适合批量样品分析的操作流程，对于保证氯苯调查评价工作的正常实施和获取可靠数据具有十分重要的意义。
利用高效液相液色谱仪（HPLC）开展了针对氯苯的研究与优化，通过控制不同的试验条件，筛选出最合适的色谱条件，以提高分析效率。該方法简便易行，适用于批量样品的分析，与气相方法相比，本方法具有分离时间短、操作简便、准确度和精密度高的优点，适用于地表水和生活饮用水中氯苯的批量分析测定。
1 材料与方法
1.1 方法原理
用有机溶剂萃取水样中的氯苯类化合物，萃取液经净化、浓缩、定容后，用带有紫外检测器的液相色谱仪（UV-HPLC）进行分析，色谱柱为C18柱，以保留时间定性，外标法定量[16]。
1.2 仪器、标准品与试剂
本试验采用了美国Thermo公司的 UltiMate3000高效液相色谱仪，配备了Thermo C18不锈钢色谱柱，4.6 mm×250.0 mm，内装粒径5 μm，所采用紫外检测器型号为VWD-3100。
流动相试剂均为色谱纯：甲醇（MercK）。采用氯苯标准溶液为水利部水环境监测评价研究中心标准样品，批号为GBW（E）081026，编号为160821，浓度为100 mg/L；采用的盲样质控为水利部水环境监测评价研究中心的标准样品，批号为GBW（E）081026，编号为150521和150621，浓度为107、180 mg/L。
1.3 标准溶液配制
按照环保部氯苯标准溶液的配制方法，样品采用甲醇稀释配制，将样品配成0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的浓度序列，并将质控盲样稀释10倍。
1.4 样品预处理
液液萃取法：取100 mL水样置于250 mL分液漏斗中，加5 g氯化钠振荡溶解，加入2.0 mL苯，振荡萃取2 min，静置分层后有机相经无水硫酸钠干燥，收集1.0 mL于样品瓶中，不再定容，提取体积以2.0 mL计。
2 结果与分析
2.1 检测波长
检测波长的选择对各组分是否有明显的波峰起关键作用，为使检测物质波峰明显、有较强的响应值，通常选择该物质的最大吸收波长作为检测波长。先采用纯甲醇作为流动相，将氯苯标准溶液在190～260 nm波长范围内每隔2 nm进行1次吸光度测试。结果显示，在210 nm波长处组分的吸收值最大，并且在210 nm处样品峰无其他组分干扰吸收，故选择氯苯的最大吸收波长210 nm为液相色谱分析时的最佳紫外监测波长。
2.2 溶剂和流动相
分别采用常用流动相甲醇和水作为载体流动相，测试不同极性大小的载体对样品分离能力的强弱。在其他色谱柱条件不变的情况下，将不同配比的甲醇和水（80∶20、85∶15、90∶10、95∶5、100∶0）作为洗脱剂在色谱柱上进行分离效果比较，根据氯苯的出峰时间、峰高、理论塔板数和峰形挑选甲醇和水的最佳配比。
结果显示，甲醇的比例越低，出峰时间越晚，分离度越好。这是因为甲醇与水相比，水的极性较强，C18为反相色谱柱，极性越强其洗脱能力反而越弱。因此，需要低极性的溶剂才能洗脱吸附在固定相上的溶质。当甲醇比例过大时，会出现氯苯与甲醇水峰难分离的现象。但是随着甲醇比例降低，峰形扩展，柱效降低，分离效果变差。综合比较，最后确定用甲醇∶水=90∶10作为流动相配比进行样品分离。
2.3 柱温和流速
柱温升高，组分在两相之间达到分配平衡的速度将加快，分析时间缩短。另外，随着柱温的升高，流动相的黏度将降低，并降低柱入口处的压力，减轻给色谱柱带来的负担。但柱温若太高，一方面柱内填料在流动相中溶解度将增大，缩短柱子的使用寿命；另一方面各组分的分离选择性也将随之变差。若柱温过低，峰形将变宽，柱效下降，分析时间延长。故本试验柱温的合适温度控制在35 ℃。
流速与柱温类似，过高的流速会导致整个仪器系统压力增大，增加仪器损坏风险；长时间高流速会使柱子填料疏松，分离效果变差，使用寿命大大降低，故本试验采用常规流速1.0 mL/min。 最终色谱条件确定为流动相为甲醇∶水=90∶10，流速为1.0 mL/min，温度35 ℃，检测波长为210 nm。分离色谱图见图1。
2.4 外标法测定氯苯含量
在上述方法确定的最佳色谱操作条件下定量进样，通过回归分析得到峰面积与氯苯标准样品序列之间的标准曲线方程（表1）。本试验浓度序列相关系数达到0.999 9，线性关系良好，线性方程为Y=0.367 8X 0.030 1。
2.5 方法检出限
向高纯水中加入待测物，配制7个较低浓度的加标样品，使其浓度为0.010 mg/L，约为预估MDL的1～5倍。用与样品相同的前处理步骤和分析步骤分析检测7个加标空白。根据美国EPA及水利行业标准《水环境监测规范》[16]（SL 219—2013）对方法检出限规定。
方法检出限计算公式：
MDL=SD×t（n-1，1-α=0.99）（1）
式中：SD为n次测量的标准偏差；t为自由度为n-1、置信度为99%的t值；n为样品重复测量的次数；1-α为置信水平。
如果重复测定7次，置信水平为99%，查t值后，公式可以简化为MDL=3.14SD=0.000 21 mg/L，则氯苯的检出限为0.21 μg/L。
测定下限又称检测限或测量限，是指在限定误差能够满足预定要求的前提下，用特定的方法能够准确定量测定被测物质的最低浓度或含量。以4MDL（检出限）为测定下限（RQL），即以4倍检出限浓度作为测定下限。根据式（1）可知，RQL=4MDL=4×0.000 21=0.000 84 mg/L。由此可知，氯苯的测定下限为0.000 84 mg/L。
2.6 精密度
将质控盲样稀释10倍后测定7次，测定结果见表2。
7次测定平均值为10.709、18.031 mg/L，因样品为稀释10倍后测定，故原样品浓度应为107.09、180.31 mg/L，测定值在真值范围内，测定值准确有效。通过计算，标准偏差为0.077 8、0.058 5 mg/L，变异系数为0.727%、0.325%。
总体来说，该方法灵敏度高、重现性好、响应快、检测限低、线性范围宽、易于操作、稳定性较好，能够满足测定的要求。
2.7 实际样品测定
2.7.1 加标回收率试验。用本试验方法测定陆水水库三线三点实际水样中的氯苯类物质，并做了双加标试验，测定结果如表3所示。
对实际水样陆水水库2采用双加标方法测定回收率，加标质量浓度为1.0、2.0 mg/L，然后进行3次平行测定，测定结果见表4。由结果可知，3次加标回收率平均值为105.1%，符合生产要求。
2.7.2 能力验证样品测定。采用该方法对2016年水利部
能力验证样品进行方法比测，已顺利通过考核。测得结果见表5。与标准方法相比，本文结果具有较好的一致性，且穩定性更高。
3 结论与讨论
本试验经多次控制变量法确定高效液相法测定氯苯的最佳色谱条件：流动相为甲醇∶水=90∶10，流速1.0 mL/min，温度35 ℃，检测波长210 nm，进样体积10 μL。本条件下高效液相色谱法测定氯苯具有操作简便、快捷、准确度和精密度较高、线性关系良好等优点。氯苯类化合物的响应值高，对测试条件要求不高，适合于在普通实验室推广，是分析氯苯的理想方法。
4 参考文献
[1] 金银龙.生活饮用水卫生标准：GB 5749-2006[S].北京：中国标准出版社，2007.
[2] 国家质量监督检验检疫总局.地表水环境质量标准：GB3838-2002[S].北京：中国标准出版社，2002.
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[14] 李晓晶，黄聪，于鸿，等.水中有机氯农药和氯苯类化合物的顶空固相微萃取-气相色潽测定法[J].环境与健康杂志，2009，26（7）：626-629.
[15] 中华人民共和国环境保护部.水质 氯苯的测定 气相色谱法：HJT 74-2001[S].北京：中国环境科学出版社，2001.
[16] 中华人民共和国水利部.水环境监测规范：SL 219-2013[S].北京：中国水利水电出版社，2014.
摘要 以UV-HPLC为监测手段，建立了氯苯的高效液相色谱分析法，系统地研究了波长、流动相配比、柱温以及流速和响应值之间的关系。该方法分析时间短、准确度高、稳定性好、操作简单、数据重复性好，已成功地应用于水利部能力验证考核样比测和地表水监测中。
关键词 UV-HPLC；氯苯；地表水监测；精确分析中图分类号 O657.7 2；X832 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）20-0158-02
氯苯类化合物是化学性质较稳定的一类有机污染物，不易分解，对环境和人体有极大危害。氯苯类化合物是我国环境监测优先控制污染物，其检测有重要意义[1-3]。因为氯苯挥发性强，在水中溶解度小，EPA和国标中对氯苯的测试分别采用气相色谱质谱联用仪GC-MS和气相色谱法ECD-GC或FID-GC。但质谱仪MS价格昂贵，一般实验室配置率不高；ECD-GC则因为氯苯中氯的质量占31.6%，比例比较低，其响应值明显弱于其他同系物，在低浓度时常常检测不到信号，适用性较差。因此，氯苯多采用FID-GC[4-9]，行业标准为《水质 氯苯的测定 气相色谱法》（HJ T74—2001）[10]。该标准使用较为落后的填充柱分离手段，不能适应现阶段发展的需要，在实际工作中，常常用毛细管柱替换，但由于氯苯出峰时间较早，如果试验条件设置不当，则不容易与溶剂峰相分离，甚至会出现在较高浓度下检测不到氯苯信号峰的情况，给实际监测工作带来影响[11-15]。因此，如何建立一种灵敏、快速、经济、适合批量样品分析的操作流程，对于保证氯苯调查评价工作的正常实施和获取可靠数据具有十分重要的意义。
利用高效液相液色谱仪（HPLC）开展了针对氯苯的研究与优化，通过控制不同的试验条件，筛选出最合适的色谱条件，以提高分析效率。該方法简便易行，适用于批量样品的分析，与气相方法相比，本方法具有分离时间短、操作简便、准确度和精密度高的优点，适用于地表水和生活饮用水中氯苯的批量分析测定。
1 材料与方法
1.1 方法原理
用有机溶剂萃取水样中的氯苯类化合物，萃取液经净化、浓缩、定容后，用带有紫外检测器的液相色谱仪（UV-HPLC）进行分析，色谱柱为C18柱，以保留时间定性，外标法定量[16]。
1.2 仪器、标准品与试剂
本试验采用了美国Thermo公司的 UltiMate3000高效液相色谱仪，配备了Thermo C18不锈钢色谱柱，4.6 mm×250.0 mm，内装粒径5 μm，所采用紫外检测器型号为VWD-3100。
流动相试剂均为色谱纯：甲醇（MercK）。采用氯苯标准溶液为水利部水环境监测评价研究中心标准样品，批号为GBW（E）081026，编号为160821，浓度为100 mg/L；采用的盲样质控为水利部水环境监测评价研究中心的标准样品，批号为GBW（E）081026，编号为150521和150621，浓度为107、180 mg/L。
1.3 标准溶液配制
按照环保部氯苯标准溶液的配制方法，样品采用甲醇稀释配制，将样品配成0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的浓度序列，并将质控盲样稀释10倍。
1.4 样品预处理
液液萃取法：取100 mL水样置于250 mL分液漏斗中，加5 g氯化钠振荡溶解，加入2.0 mL苯，振荡萃取2 min，静置分层后有机相经无水硫酸钠干燥，收集1.0 mL于样品瓶中，不再定容，提取体积以2.0 mL计。
2 结果与分析
2.1 检测波长
检测波长的选择对各组分是否有明显的波峰起关键作用，为使检测物质波峰明显、有较强的响应值，通常选择该物质的最大吸收波长作为检测波长。先采用纯甲醇作为流动相，将氯苯标准溶液在190～260 nm波长范围内每隔2 nm进行1次吸光度测试。结果显示，在210 nm波长处组分的吸收值最大，并且在210 nm处样品峰无其他组分干扰吸收，故选择氯苯的最大吸收波长210 nm为液相色谱分析时的最佳紫外监测波长。
2.2 溶剂和流动相
分别采用常用流动相甲醇和水作为载体流动相，测试不同极性大小的载体对样品分离能力的强弱。在其他色谱柱条件不变的情况下，将不同配比的甲醇和水（80∶20、85∶15、90∶10、95∶5、100∶0）作为洗脱剂在色谱柱上进行分离效果比较，根据氯苯的出峰时间、峰高、理论塔板数和峰形挑选甲醇和水的最佳配比。
结果显示，甲醇的比例越低，出峰时间越晚，分离度越好。这是因为甲醇与水相比，水的极性较强，C18为反相色谱柱，极性越强其洗脱能力反而越弱。因此，需要低极性的溶剂才能洗脱吸附在固定相上的溶质。当甲醇比例过大时，会出现氯苯与甲醇水峰难分离的现象。但是随着甲醇比例降低，峰形扩展，柱效降低，分离效果变差。综合比较，最后确定用甲醇∶水=90∶10作为流动相配比进行样品分离。
2.3 柱温和流速
柱温升高，组分在两相之间达到分配平衡的速度将加快，分析时间缩短。另外，随着柱温的升高，流动相的黏度将降低，并降低柱入口处的压力，减轻给色谱柱带来的负担。但柱温若太高，一方面柱内填料在流动相中溶解度将增大，缩短柱子的使用寿命；另一方面各组分的分离选择性也将随之变差。若柱温过低，峰形将变宽，柱效下降，分析时间延长。故本试验柱温的合适温度控制在35 ℃。
流速与柱温类似，过高的流速会导致整个仪器系统压力增大，增加仪器损坏风险；长时间高流速会使柱子填料疏松，分离效果变差，使用寿命大大降低，故本试验采用常规流速1.0 mL/min。 最终色谱条件确定为流动相为甲醇∶水=90∶10，流速为1.0 mL/min，温度35 ℃，检测波长为210 nm。分离色谱图见图1。
2.4 外标法测定氯苯含量
在上述方法确定的最佳色谱操作条件下定量进样，通过回归分析得到峰面积与氯苯标准样品序列之间的标准曲线方程（表1）。本试验浓度序列相关系数达到0.999 9，线性关系良好，线性方程为Y=0.367 8X 0.030 1。
2.5 方法检出限
向高纯水中加入待测物，配制7个较低浓度的加标样品，使其浓度为0.010 mg/L，约为预估MDL的1～5倍。用与样品相同的前处理步骤和分析步骤分析检测7个加标空白。根据美国EPA及水利行业标准《水环境监测规范》[16]（SL 219—2013）对方法检出限规定。
方法检出限计算公式：
MDL=SD×t（n-1，1-α=0.99）（1）
式中：SD为n次测量的标准偏差；t为自由度为n-1、置信度为99%的t值；n为样品重复测量的次数；1-α为置信水平。
如果重复测定7次，置信水平为99%，查t值后，公式可以简化为MDL=3.14SD=0.000 21 mg/L，则氯苯的检出限为0.21 μg/L。
测定下限又称检测限或测量限，是指在限定误差能够满足预定要求的前提下，用特定的方法能够准确定量测定被测物质的最低浓度或含量。以4MDL（检出限）为测定下限（RQL），即以4倍检出限浓度作为测定下限。根据式（1）可知，RQL=4MDL=4×0.000 21=0.000 84 mg/L。由此可知，氯苯的测定下限为0.000 84 mg/L。
2.6 精密度
将质控盲样稀释10倍后测定7次，测定结果见表2。
7次测定平均值为10.709、18.031 mg/L，因样品为稀释10倍后测定，故原样品浓度应为107.09、180.31 mg/L，测定值在真值范围内，测定值准确有效。通过计算，标准偏差为0.077 8、0.058 5 mg/L，变异系数为0.727%、0.325%。
总体来说，该方法灵敏度高、重现性好、响应快、检测限低、线性范围宽、易于操作、稳定性较好，能够满足测定的要求。
2.7 实际样品测定
2.7.1 加标回收率试验。用本试验方法测定陆水水库三线三点实际水样中的氯苯类物质，并做了双加标试验，测定结果如表3所示。
对实际水样陆水水库2采用双加标方法测定回收率，加标质量浓度为1.0、2.0 mg/L，然后进行3次平行测定，测定结果见表4。由结果可知，3次加标回收率平均值为105.1%，符合生产要求。
2.7.2 能力验证样品测定。采用该方法对2016年水利部
能力验证样品进行方法比测，已顺利通过考核。测得结果见表5。与标准方法相比，本文结果具有较好的一致性，且穩定性更高。
3 结论与讨论
本试验经多次控制变量法确定高效液相法测定氯苯的最佳色谱条件：流动相为甲醇∶水=90∶10，流速1.0 mL/min，温度35 ℃，检测波长210 nm，进样体积10 μL。本条件下高效液相色谱法测定氯苯具有操作简便、快捷、准确度和精密度较高、线性关系良好等优点。氯苯类化合物的响应值高，对测试条件要求不高，适合于在普通实验室推广，是分析氯苯的理想方法。
4 参考文献
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