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摘要：DNA条形码技术是近几年迅速发展的一种基于分子水平的物种鉴定技术，基本原理是根据不同物种间特定基因片段的序列差异，利用生物信息学技术对物种进行快速分类和鉴定，在植物的物种鉴定中已有较广泛的应用。本文从植物DNA条形码鉴定的步骤、DNA条形码在植物鉴定中的研究进展方面进行综述，并提出DNA条形码技术在植物中应用的一些展望。
关键词：DNA条形码；植物；品种鉴定
中图分类号： S571.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0019-03
常用的植物鉴定方法有表型鉴定和分子水平鉴定。由于生长环境、加工方式的差异，植物外观形态出现较大变化，因此在实际应用中很难通过表现型对其进行物种鉴定。DNA是一种稳定的生物大分子，利用DNA分子水平的鉴定方法能准确有效地对新鲜和加工过的植物样品进行鉴定，避免表型鉴定造成的误差和生化检测的繁杂操作。目前常用的DNA鉴定方法有DNA指纹图谱技术、DNA芯片技术和DNA条形码技术等。DNA条形码技术是利用一段短而标准的DNA序列作为标记来实现快速、准确和自动化物种鉴定的方法，是由加拿大的动物学家Herbert在2003年提出的[1]，经过多年的发展DNA条形码技术在分子系统发育、进化生态学[2]等研究和动植物品种、食品组成[3]、法医物证等鉴定中有广泛的应用。
1 植物DNA条形码鉴定的步骤
1.1 植物DNA提取
提取一定浓度和纯度的DNA是完成植物DNA条形码研究的前提。目前常用的植物DNA提取方法有CTAB法、SDS法、高盐低pH值法和试剂盒法等，在提取植物样品DNA前，应针对其特异性选择合适的DNA提取方法。对于新鲜的植物样品，一般采用传统的CTAB法或者常规的植物DNA提取试剂盒提取即可得到一定质量的植物样品DNA。对于干燥或者经特殊处理过的植物样品，则须根据样品的特性对传统的方法进行改良。刘少峰利用CTAB法、CTAB法联用试剂盒法和试剂盒法分别提取沉香的总DNA，结果表明CTAB法联合试剂盒法提取的DNA，经PCR扩增后目的片段的产率最高，且方法简单、快速[4]。Costa等利用改良的试剂盒法提取植物性滋补品和茶叶的总DNA[5-6]，Arolla等对CTAB法进行改良[7-8]，成功提取出穿心莲属和黏液质种子的总DNA，DNA浓度均较高且电泳条带清晰。
1.2 陆地植物通用的DNA条形码序列选择
生命条形码联盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）作为全球DNA条形码研究的权威机构，在综合以往研究和工作组所提供数据的分析结果，建议将叶绿体基因rbcL、matK、trnH-psbA和核基因ITS作为陆地植物通用的DNA条形码[9-10]。
1.2.1 rbcL序列 rbcL片段在GenBank中有大量的序列数据，并且具有通用、易扩增、易比对的特点，因而被提议作为条形码片段，但是rbcL的变异主要存在于种以上水平，物种水平上通常变异不够大。此外，rbcL的整体长度较长（至少 1 300 bp），给整个基因的测序带来了困难。
1.2.2 matK序列 与其他编码区片段相比，matK片段的进化速率较快，但该片段的引物通用性较差，鉴定不同类群时往往需要设计不同的引物，其引物通用性和扩增成功率有待进一步检验，适用于种属水平的物种鉴别。
1.2.3 trnH-psbA序列 trnH-psbA片段作为植物DNA条形码最大的优势是进化速率快，但同时也由于插入/缺失过多引起了较高的突变率和简单的序列重复和重排，在进行序列分析时需要辅以人工校正，而给非同属物种间的比对带来了较大困难。不过，比对容易与否并不是条形码必需的条件，一旦建立恰当的条形码数据分析方法，插入/缺失还将会增加物种识别所需要的信息。
1.2.4 ITS序列 ITS片段在物种水平上变异较大，且已广泛应用于物种分类及系统进化研究，然而扩增成功率是ITS作为条形码应用的一个限制因素，主要表现为：其长度变异大，多数物种扩增片段长度超过1 100 bp，需要使用中间引物才能扩增获得整个基因，且存在长的poly结构，导致测序和序列分析困难。另外，核基因本身存在多拷贝的特性，在种内序列变异较大，进一步降低了该片段作为条形码的应用性[9，11-12]。
除了以上这4种DNA条形码序列，trnL、rpoC1、rpoB、ndhJ等DNA片段也常作为植物的DNA条形码序列[13]，另外，将不同的DNA片段进行组合可提高DNA条形码的鉴定能力[14-5]。
1.3 植物DNA条形码数据分析
将特定序列PCR扩增后的产物回收、纯化、測序，即得到植物样本的目的基因序列，此时须对其进行人工校正再使用序列处理软件进行拼接，去除低质量序列及引物区[16]。常用序列拼接软件有CodonCode Aligner V2.06（CodonCode Co. USA）和DNAMAN等。校正拼接后的序列即可进行DNA条形码的数据分析，常用的方法有Blast分析、遗传距离比较和系统进化关系的构建3种方式[16]。Blast即局部相似性基本查询工具，是由NCBI开发的基于序列相似性的数据库搜索程序，将待研究序列与DNA序列库进行比较，即可确定该序列的生物属性；遗传距离分析是运用MEGA等软件工具，采用Kimura-2-Parameter distance（K2P） 或者 pairwise uncorrected p-distance模型来计算种间距离，通过种内、种间的差异比较确定种内及种间变异的阈值，从而对未知植物样品进行检索与鉴定[17-18]；系统进化关系一般用进化树来描述，以确定同一谱系植物的进化关系。
3 DNA条形码技术在植物鉴定中的应用现状 [25]王 俊，刘 霞，孙 伟，等. 名贵药材血竭的DNA条形码鉴定研究[J]. 中国药学杂志，2015（15）：1261-1265.
[26]Lv T，Teng R，Shao Q，et al. DNA barcodes for the identification of Anoectochilus roxburghii and its adulterants[J]. Planta，2015，242（5）：1167-1174.
[27]Silva J N，Da Costa A B，Silva J V，et al. DNA barcoding and phylogeny in neotropical species of the genus Spondias[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2015，61：240-243.
[28]Zhu X，Zhang Y，Liu X，et al. Authentication of commercial processed Glehniae Radix （Beishashen） by DNA barcodes[J]. Chinese Medicine，2015，10（9）：35.
[29]杨 培. 石斛、北豆根、肉桂的DNA条形码鉴定及石斛叶绿体基因组研究[D]. 北京：北京协和医学院，2015.
[30]杨雪莹，宋炳轲，裴 黎，等. 植物物证的DNA条形码鉴定分析[J]. 中国法医学杂志，2015，30（2）：189-190.
[31]杨雪莹，曹海丹，裴 黎，等. 基于ITS2条形码序列对新型“香料”毒品植物成分的研究[J]. 刑事技术，2015，40（1）：71-73.
[32]宋炳轲，杨雪莹，倪萍娅，等. DNA条形码技术在毒品原植物大麻鉴定中的作用[J]. 广西植物，2014，34（4）：552-556.
[33]宋炳轲，冯 涛，杨雪莹，等. 基于psbA-trnH条形码的毒品原植物大麻及其混伪品的鉴别[J]. 刑事技术，2014（6）：39-41.
[34]焦丽娟，税玉民. 中国秋海棠属（秋海棠科）植物的DNA条形码评价[J]. 植物分类与资源学报，2013，35（6）：715-724.
[35]张玉霄，许宇星，马朋飞，等. 竹亚科叶绿体DNA条形码筛选[J]. 植物分类与资源学报，2013，35（6）：743-750.
[36]董洋龙，於林江，周 拓，等. 基于ITS技术的11个茶花品种遗传多样性研究[J]. 中国农学通报，29（13）：145-149.
[37]黄卫娟. 荞麦及其野生近缘种的DNA条形码鉴定[D]. 北京：中央民族大学，2014.
[38]von Crutlein M，Korpelainen H，Pietilinen M，et al. DNA barcoding：a tool for improved taxon identification and detection of species diversity[J]. Biodiversity and Conservation，2011，20（2）：373-389.
[39]楊雪莹，曹海丹，裴 黎. 采用DNA条形码技术鉴定常见杨树种属初探[J]. 中国法医学杂志，2015，30（1）：9-11，15.
[40]Ren B Q，Xiang X G，Chen Z D. Species identification of Alnus （Betulaceae） using nrDNA and cpDNA genetic markers[J]. Molecular Ecology Resources，2010，10（4）：594-605.
[41]刘 娜，李梦臻. DNA条形码技术在病原真菌分类鉴定中的应用[J]. 江苏农业科学，2015，43（3）：10-12.
[42]丁摇潜，邢光东，胡肄农，等. 识别杜洛克猪个体身份的DNA条形码[J]. 江苏农业学报，2014，30（5）：1058-1063.
[43]胡伟毅，汪连军，豢国勋，等. 5种DNA条形码在苍耳属中遗传距离比较[J]. 江苏农业科学，2014，42（4）：36-38.
关键词：DNA条形码；植物；品种鉴定
中图分类号： S571.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0019-03
常用的植物鉴定方法有表型鉴定和分子水平鉴定。由于生长环境、加工方式的差异，植物外观形态出现较大变化，因此在实际应用中很难通过表现型对其进行物种鉴定。DNA是一种稳定的生物大分子，利用DNA分子水平的鉴定方法能准确有效地对新鲜和加工过的植物样品进行鉴定，避免表型鉴定造成的误差和生化检测的繁杂操作。目前常用的DNA鉴定方法有DNA指纹图谱技术、DNA芯片技术和DNA条形码技术等。DNA条形码技术是利用一段短而标准的DNA序列作为标记来实现快速、准确和自动化物种鉴定的方法，是由加拿大的动物学家Herbert在2003年提出的[1]，经过多年的发展DNA条形码技术在分子系统发育、进化生态学[2]等研究和动植物品种、食品组成[3]、法医物证等鉴定中有广泛的应用。
1 植物DNA条形码鉴定的步骤
1.1 植物DNA提取
提取一定浓度和纯度的DNA是完成植物DNA条形码研究的前提。目前常用的植物DNA提取方法有CTAB法、SDS法、高盐低pH值法和试剂盒法等，在提取植物样品DNA前，应针对其特异性选择合适的DNA提取方法。对于新鲜的植物样品，一般采用传统的CTAB法或者常规的植物DNA提取试剂盒提取即可得到一定质量的植物样品DNA。对于干燥或者经特殊处理过的植物样品，则须根据样品的特性对传统的方法进行改良。刘少峰利用CTAB法、CTAB法联用试剂盒法和试剂盒法分别提取沉香的总DNA，结果表明CTAB法联合试剂盒法提取的DNA，经PCR扩增后目的片段的产率最高，且方法简单、快速[4]。Costa等利用改良的试剂盒法提取植物性滋补品和茶叶的总DNA[5-6]，Arolla等对CTAB法进行改良[7-8]，成功提取出穿心莲属和黏液质种子的总DNA，DNA浓度均较高且电泳条带清晰。
1.2 陆地植物通用的DNA条形码序列选择
生命条形码联盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）作为全球DNA条形码研究的权威机构，在综合以往研究和工作组所提供数据的分析结果，建议将叶绿体基因rbcL、matK、trnH-psbA和核基因ITS作为陆地植物通用的DNA条形码[9-10]。
1.2.1 rbcL序列 rbcL片段在GenBank中有大量的序列数据，并且具有通用、易扩增、易比对的特点，因而被提议作为条形码片段，但是rbcL的变异主要存在于种以上水平，物种水平上通常变异不够大。此外，rbcL的整体长度较长（至少 1 300 bp），给整个基因的测序带来了困难。
1.2.2 matK序列 与其他编码区片段相比，matK片段的进化速率较快，但该片段的引物通用性较差，鉴定不同类群时往往需要设计不同的引物，其引物通用性和扩增成功率有待进一步检验，适用于种属水平的物种鉴别。
1.2.3 trnH-psbA序列 trnH-psbA片段作为植物DNA条形码最大的优势是进化速率快，但同时也由于插入/缺失过多引起了较高的突变率和简单的序列重复和重排，在进行序列分析时需要辅以人工校正，而给非同属物种间的比对带来了较大困难。不过，比对容易与否并不是条形码必需的条件，一旦建立恰当的条形码数据分析方法，插入/缺失还将会增加物种识别所需要的信息。
1.2.4 ITS序列 ITS片段在物种水平上变异较大，且已广泛应用于物种分类及系统进化研究，然而扩增成功率是ITS作为条形码应用的一个限制因素，主要表现为：其长度变异大，多数物种扩增片段长度超过1 100 bp，需要使用中间引物才能扩增获得整个基因，且存在长的poly结构，导致测序和序列分析困难。另外，核基因本身存在多拷贝的特性，在种内序列变异较大，进一步降低了该片段作为条形码的应用性[9，11-12]。
除了以上这4种DNA条形码序列，trnL、rpoC1、rpoB、ndhJ等DNA片段也常作为植物的DNA条形码序列[13]，另外，将不同的DNA片段进行组合可提高DNA条形码的鉴定能力[14-5]。
1.3 植物DNA条形码数据分析
将特定序列PCR扩增后的产物回收、纯化、測序，即得到植物样本的目的基因序列，此时须对其进行人工校正再使用序列处理软件进行拼接，去除低质量序列及引物区[16]。常用序列拼接软件有CodonCode Aligner V2.06（CodonCode Co. USA）和DNAMAN等。校正拼接后的序列即可进行DNA条形码的数据分析，常用的方法有Blast分析、遗传距离比较和系统进化关系的构建3种方式[16]。Blast即局部相似性基本查询工具，是由NCBI开发的基于序列相似性的数据库搜索程序，将待研究序列与DNA序列库进行比较，即可确定该序列的生物属性；遗传距离分析是运用MEGA等软件工具，采用Kimura-2-Parameter distance（K2P） 或者 pairwise uncorrected p-distance模型来计算种间距离，通过种内、种间的差异比较确定种内及种间变异的阈值，从而对未知植物样品进行检索与鉴定[17-18]；系统进化关系一般用进化树来描述，以确定同一谱系植物的进化关系。
3 DNA条形码技术在植物鉴定中的应用现状 [25]王 俊，刘 霞，孙 伟，等. 名贵药材血竭的DNA条形码鉴定研究[J]. 中国药学杂志，2015（15）：1261-1265.
[26]Lv T，Teng R，Shao Q，et al. DNA barcodes for the identification of Anoectochilus roxburghii and its adulterants[J]. Planta，2015，242（5）：1167-1174.
[27]Silva J N，Da Costa A B，Silva J V，et al. DNA barcoding and phylogeny in neotropical species of the genus Spondias[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2015，61：240-243.
[28]Zhu X，Zhang Y，Liu X，et al. Authentication of commercial processed Glehniae Radix （Beishashen） by DNA barcodes[J]. Chinese Medicine，2015，10（9）：35.
[29]杨 培. 石斛、北豆根、肉桂的DNA条形码鉴定及石斛叶绿体基因组研究[D]. 北京：北京协和医学院，2015.
[30]杨雪莹，宋炳轲，裴 黎，等. 植物物证的DNA条形码鉴定分析[J]. 中国法医学杂志，2015，30（2）：189-190.
[31]杨雪莹，曹海丹，裴 黎，等. 基于ITS2条形码序列对新型“香料”毒品植物成分的研究[J]. 刑事技术，2015，40（1）：71-73.
[32]宋炳轲，杨雪莹，倪萍娅，等. DNA条形码技术在毒品原植物大麻鉴定中的作用[J]. 广西植物，2014，34（4）：552-556.
[33]宋炳轲，冯 涛，杨雪莹，等. 基于psbA-trnH条形码的毒品原植物大麻及其混伪品的鉴别[J]. 刑事技术，2014（6）：39-41.
[34]焦丽娟，税玉民. 中国秋海棠属（秋海棠科）植物的DNA条形码评价[J]. 植物分类与资源学报，2013，35（6）：715-724.
[35]张玉霄，许宇星，马朋飞，等. 竹亚科叶绿体DNA条形码筛选[J]. 植物分类与资源学报，2013，35（6）：743-750.
[36]董洋龙，於林江，周 拓，等. 基于ITS技术的11个茶花品种遗传多样性研究[J]. 中国农学通报，29（13）：145-149.
[37]黄卫娟. 荞麦及其野生近缘种的DNA条形码鉴定[D]. 北京：中央民族大学，2014.
[38]von Crutlein M，Korpelainen H，Pietilinen M，et al. DNA barcoding：a tool for improved taxon identification and detection of species diversity[J]. Biodiversity and Conservation，2011，20（2）：373-389.
[39]楊雪莹，曹海丹，裴 黎. 采用DNA条形码技术鉴定常见杨树种属初探[J]. 中国法医学杂志，2015，30（1）：9-11，15.
[40]Ren B Q，Xiang X G，Chen Z D. Species identification of Alnus （Betulaceae） using nrDNA and cpDNA genetic markers[J]. Molecular Ecology Resources，2010，10（4）：594-605.
[41]刘 娜，李梦臻. DNA条形码技术在病原真菌分类鉴定中的应用[J]. 江苏农业科学，2015，43（3）：10-12.
[42]丁摇潜，邢光东，胡肄农，等. 识别杜洛克猪个体身份的DNA条形码[J]. 江苏农业学报，2014，30（5）：1058-1063.
[43]胡伟毅，汪连军，豢国勋，等. 5种DNA条形码在苍耳属中遗传距离比较[J]. 江苏农业科学，2014，42（4）：36-38.