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摘 要：建立一种高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD）变波长梯度洗脱同时测定果蔬汁饮料中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝9种食品添加剂的检测方法。样品用水提取，采用
C18色谱柱分离，以甲醇和0.02 mol/L乙酸铵溶液进行梯度洗脱，DAD变波长进行检测，出峰时间定性，外标法定量。该方法9种食品添加剂在0.0～50 μg/mL具有良好的线性关系，相关系数均大于0.999 5，回收率为91.5%～107%，相对标准偏差为1.8%～6.8%。检出限为0.008 3～0.029 mg/kg，定量限为0.025～0.087 mg/kg。该方法前处理简单，色谱分离效果好，结果精确，适合果蔬汁饮料中的9种食品添加剂的同时测定。
关键词：HPLC-DAD;果蔬汁饮料;食品添加剂;变波长;梯度洗脱
食品添加剂是指为改善食品品质和色、香、味以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质[1]，可改善和提高食品的感官指标，保持食品的营养价值，增加花色品种，调整营养结构，延长保质期，改进加工条件[2]。合成着色剂、甜味剂、防腐剂是果蔬汁饮料中最常使用的食品添加剂，对促进果蔬汁饮料的产品质量提升发挥了重要的作用[3]。有研究发现，过量摄入甜味剂、防腐剂、合成着色剂会对肠、肝、肾及神经系统和消化系统造成损害[4-6]。国家标准《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760―2014）[1]中对食品添加剂使用量有着严格的控制。
从2020年公布的国家食品安全监督抽检情况[7-8]可见，超范围、超限量使用食品添加剂仍然存在且存在联合使用超量问题。但目前检测这些食品添加剂的标准不尽相同[9-12]，逐一检测耗时耗力，发生食品安全问题时不能及时提供技术支持，造成监管部门把控食品安全风险的时效性减弱[4]。
因此，本方法拟建立一种针对果蔬汁饮料中常进行检测的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝9种食品添加剂采用最佳吸收波长变波长梯度洗脱同时进行测定的方法，有利于降本增效，为食品安全监管提供方法参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent1260高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器。
甲醇（GR）、乙酸铵（AR）、实验用水等。安赛蜜、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝标准储备液，质量浓度均为1 000 μg/mL，室温避光保存，购于海岸鸿蒙标准物质技术有限公司;苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准品，0～8 ℃避光保存，购于BePure公司。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液配制
准确称取苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准品0.01 g（精确至0.000 1 g）至10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得质量浓度为1 000 μg/mL的标准储备液。分别吸取9种食品添加剂标准储备液10 μL、50 μL、100 μL、200 μL和500 μL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，即得1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和50 μg/mL的混合标准工作溶液。
1.2.2 样品前处理
样品充分混匀，准确称取样品5 g至25 mL比色管中，加约15 mL水，涡旋混匀，超声30 min，冷却后调pH至6～7，用水定容至25 mL。用0.45 μm水相滤膜过滤，滤液备用。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：C18（4.6×250 mm，5 μm）;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：10 μL;流动相：B相为甲醇，D相为0.02 mol/L乙酸铵溶液，梯度进行洗脱，检测波长和洗脱条件见表1。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法的改进
果蔬汁饮料基质相对简单，不含蛋白和脂肪，故可以不用聚酰胺粉吸附洗脱合成着色剂，不用沉淀蛋白和去除脂肪的步骤进行食品添加剂的检测，简化了前处理过程，大大提高了工作效率。根据检测方法的原理，最终确定前处理方法为称取样品5 g至25 mL比色管中，加约15 mL水，涡旋混匀，超声30 min，冷却后调pH至6～7，用水定容至25 mL。用
0.45 μm水相滤膜过滤，滤液备用。
2.2 检测波长和梯度洗脱的选择
采用DAD对9种食品添加剂混合标准工作溶液采集210～700 nm光谱图，扫描其最佳吸收波长，经过反复试验，最终确定变波长条件见表1。梯度洗脱条件在标准的基础上考虑各个添加剂在流动相中的溶解度及色谱柱的分离效果，采用甲醇和20 mmol/L乙酸铵为流动相，反复试验不同梯度条件洗脱的分离效果，最终确定采用表1的梯度洗脱程序能实现9种食品添加剂的较好分离，混合标准工作溶液色谱图见图1。
2.3 线性范围及检出限、定量限
将9种食品添加剂混合标准工作溶液按1.2.3中色谱条件上机测定，以质量浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线、相关系数、检出限和定量限见表2。
2.4 方法的加标回收率和精密度
稱取已知含量的样品5 g，在样品中加入标准溶液，按1.2.2进行样品处理，按上述1.2.3中色谱条件上机测定，结果见表3。回收率范围为91.5%～107%，相对标准偏差范围为1.8%～6.8%。
2.5 实际果蔬汁饮料样品的测定
用本实验方法对市售的果蔬汁饮料进行8个样品测定分析，每个样品重复测定2次。检测结果见表4。结果发现，8个样品中同时检出安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、柠檬黄、胭脂红、日落黄6种食品添加剂的样品有1个，同时检出安赛蜜、山梨酸、柠檬黄、日落黄、亮蓝5种食品添加剂的样品有1个，同时检出安赛蜜、山梨酸、柠檬黄、日落黄4种食品添加剂的样品有1个，只检出安赛蜜的样品有1个，只检出苯甲酸的样品有3个。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[1]中对食品添加剂的使用限量标准，所检出样品的添加剂含量均符合国家标准要求。 3 结论
本研究建立了一种HPLC-DAD变波长梯度洗脱同时测定果蔬汁饮料中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝9种食品添加剂的检测方法。针对果蔬汁饮料的特点，优化了前处理方法，采用变波长梯度洗脱实现了9种食品添加剂的同时测定。结果表明，该方法前处理简单，色谱分离效果好，结果精确，适合果蔬汁饮料中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝9种食品添加剂的同时测定，很大程度上提高了工作效率，降低了实验成本，为食品安全监管提供了有力支持和有效保障。
参考文献
[1]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2015.
[2]周德祥.正确认识食品添加剂的作用及危害[J].现代食品，2017（3）：51-53.
[3]陈旋，王梦格.食品添加剂在饮料中的应用及危害浅谈[J].农村经济与科技，2019（14）：32.
[4]解楠.高效液相色谱法同时测定饮料和果冻中9种食品添加剂[J].食品安全检测学报，2021，12（4）：1524-1530.
[5]毛伟峰，宋雁.食品中常见甜味剂使用方面存在的主要问题及危害[J].食品科学技术学报，2018，36（6）：9-14.
[6]赵俊.食品添加剂危害知多少[J].中国防伪报道，2017（7）：98-99.
[7]食品安全抽检监测司.市场监管总局关于2020年上半年食品安全监督抽检情况分析的通告[EB/OL].（2020-07-30）[2021-06-02].http：//gkml.samr.gov.cn/nsjg/spcjs/202007/t20200730_320364.html.
[8]食品安全抽检监测司.市场监管总局关于2020年第三季度食品安全监督抽检情况分析的通告[EB/OL].（2020-11-16）[2021-06-02].http：//gkml.samr.gov.cn/nsjg/spcjs/202011/t20201116_323570.html.
[9]卫生部，中国国家标准化管理委员会.饮料中乙酰磺胺酸钾的测定： GB/T 5009.140—2003[S].北京：中国标准出版社，2004.
[10]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定：GB/T 5009.28—2016[S].北京：中國标准出版
社，2017.
[11]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定：GB 5009.121—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.
[12]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定：GB 5009.35—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.
C18色谱柱分离，以甲醇和0.02 mol/L乙酸铵溶液进行梯度洗脱，DAD变波长进行检测，出峰时间定性，外标法定量。该方法9种食品添加剂在0.0～50 μg/mL具有良好的线性关系，相关系数均大于0.999 5，回收率为91.5%～107%，相对标准偏差为1.8%～6.8%。检出限为0.008 3～0.029 mg/kg，定量限为0.025～0.087 mg/kg。该方法前处理简单，色谱分离效果好，结果精确，适合果蔬汁饮料中的9种食品添加剂的同时测定。
关键词：HPLC-DAD;果蔬汁饮料;食品添加剂;变波长;梯度洗脱
食品添加剂是指为改善食品品质和色、香、味以及为防腐、保鲜和加工工艺的需要而加入食品中的人工合成或者天然物质[1]，可改善和提高食品的感官指标，保持食品的营养价值，增加花色品种，调整营养结构，延长保质期，改进加工条件[2]。合成着色剂、甜味剂、防腐剂是果蔬汁饮料中最常使用的食品添加剂，对促进果蔬汁饮料的产品质量提升发挥了重要的作用[3]。有研究发现，过量摄入甜味剂、防腐剂、合成着色剂会对肠、肝、肾及神经系统和消化系统造成损害[4-6]。国家标准《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760―2014）[1]中对食品添加剂使用量有着严格的控制。
从2020年公布的国家食品安全监督抽检情况[7-8]可见，超范围、超限量使用食品添加剂仍然存在且存在联合使用超量问题。但目前检测这些食品添加剂的标准不尽相同[9-12]，逐一检测耗时耗力，发生食品安全问题时不能及时提供技术支持，造成监管部门把控食品安全风险的时效性减弱[4]。
因此，本方法拟建立一种针对果蔬汁饮料中常进行检测的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝9种食品添加剂采用最佳吸收波长变波长梯度洗脱同时进行测定的方法，有利于降本增效，为食品安全监管提供方法参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent1260高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器。
甲醇（GR）、乙酸铵（AR）、实验用水等。安赛蜜、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝标准储备液，质量浓度均为1 000 μg/mL，室温避光保存，购于海岸鸿蒙标准物质技术有限公司;苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准品，0～8 ℃避光保存，购于BePure公司。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液配制
准确称取苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准品0.01 g（精确至0.000 1 g）至10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得质量浓度为1 000 μg/mL的标准储备液。分别吸取9种食品添加剂标准储备液10 μL、50 μL、100 μL、200 μL和500 μL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，即得1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL和50 μg/mL的混合标准工作溶液。
1.2.2 样品前处理
样品充分混匀，准确称取样品5 g至25 mL比色管中，加约15 mL水，涡旋混匀，超声30 min，冷却后调pH至6～7，用水定容至25 mL。用0.45 μm水相滤膜过滤，滤液备用。
1.2.3 色谱条件
色谱柱：C18（4.6×250 mm，5 μm）;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：10 μL;流动相：B相为甲醇，D相为0.02 mol/L乙酸铵溶液，梯度进行洗脱，检测波长和洗脱条件见表1。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法的改进
果蔬汁饮料基质相对简单，不含蛋白和脂肪，故可以不用聚酰胺粉吸附洗脱合成着色剂，不用沉淀蛋白和去除脂肪的步骤进行食品添加剂的检测，简化了前处理过程，大大提高了工作效率。根据检测方法的原理，最终确定前处理方法为称取样品5 g至25 mL比色管中，加约15 mL水，涡旋混匀，超声30 min，冷却后调pH至6～7，用水定容至25 mL。用
0.45 μm水相滤膜过滤，滤液备用。
2.2 检测波长和梯度洗脱的选择
采用DAD对9种食品添加剂混合标准工作溶液采集210～700 nm光谱图，扫描其最佳吸收波长，经过反复试验，最终确定变波长条件见表1。梯度洗脱条件在标准的基础上考虑各个添加剂在流动相中的溶解度及色谱柱的分离效果，采用甲醇和20 mmol/L乙酸铵为流动相，反复试验不同梯度条件洗脱的分离效果，最终确定采用表1的梯度洗脱程序能实现9种食品添加剂的较好分离，混合标准工作溶液色谱图见图1。
2.3 线性范围及检出限、定量限
将9种食品添加剂混合标准工作溶液按1.2.3中色谱条件上机测定，以质量浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线、相关系数、检出限和定量限见表2。
2.4 方法的加标回收率和精密度
稱取已知含量的样品5 g，在样品中加入标准溶液，按1.2.2进行样品处理，按上述1.2.3中色谱条件上机测定，结果见表3。回收率范围为91.5%～107%，相对标准偏差范围为1.8%～6.8%。
2.5 实际果蔬汁饮料样品的测定
用本实验方法对市售的果蔬汁饮料进行8个样品测定分析，每个样品重复测定2次。检测结果见表4。结果发现，8个样品中同时检出安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、柠檬黄、胭脂红、日落黄6种食品添加剂的样品有1个，同时检出安赛蜜、山梨酸、柠檬黄、日落黄、亮蓝5种食品添加剂的样品有1个，同时检出安赛蜜、山梨酸、柠檬黄、日落黄4种食品添加剂的样品有1个，只检出安赛蜜的样品有1个，只检出苯甲酸的样品有3个。根据《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[1]中对食品添加剂的使用限量标准，所检出样品的添加剂含量均符合国家标准要求。 3 结论
本研究建立了一种HPLC-DAD变波长梯度洗脱同时测定果蔬汁饮料中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝9种食品添加剂的检测方法。针对果蔬汁饮料的特点，优化了前处理方法，采用变波长梯度洗脱实现了9种食品添加剂的同时测定。结果表明，该方法前处理简单，色谱分离效果好，结果精确，适合果蔬汁饮料中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝9种食品添加剂的同时测定，很大程度上提高了工作效率，降低了实验成本，为食品安全监管提供了有力支持和有效保障。
参考文献
[1]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2015.
[2]周德祥.正确认识食品添加剂的作用及危害[J].现代食品，2017（3）：51-53.
[3]陈旋，王梦格.食品添加剂在饮料中的应用及危害浅谈[J].农村经济与科技，2019（14）：32.
[4]解楠.高效液相色谱法同时测定饮料和果冻中9种食品添加剂[J].食品安全检测学报，2021，12（4）：1524-1530.
[5]毛伟峰，宋雁.食品中常见甜味剂使用方面存在的主要问题及危害[J].食品科学技术学报，2018，36（6）：9-14.
[6]赵俊.食品添加剂危害知多少[J].中国防伪报道，2017（7）：98-99.
[7]食品安全抽检监测司.市场监管总局关于2020年上半年食品安全监督抽检情况分析的通告[EB/OL].（2020-07-30）[2021-06-02].http：//gkml.samr.gov.cn/nsjg/spcjs/202007/t20200730_320364.html.
[8]食品安全抽检监测司.市场监管总局关于2020年第三季度食品安全监督抽检情况分析的通告[EB/OL].（2020-11-16）[2021-06-02].http：//gkml.samr.gov.cn/nsjg/spcjs/202011/t20201116_323570.html.
[9]卫生部，中国国家标准化管理委员会.饮料中乙酰磺胺酸钾的测定： GB/T 5009.140—2003[S].北京：中国标准出版社，2004.
[10]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定：GB/T 5009.28—2016[S].北京：中國标准出版
社，2017.
[11]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定：GB 5009.121—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.
[12]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定：GB 5009.35—2016[S].北京：中国标准出版社，2017.