【摘 要】
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目的运用慢病毒载体系统构建人微小非编码RNA(miR-203)的重组慢病毒载体,并感染人慢性粒细胞白血病细胞(K562),观察其对K562细胞增殖与凋亡的影响。方法合成miR-203的前体序
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目的运用慢病毒载体系统构建人微小非编码RNA(miR-203)的重组慢病毒载体,并感染人慢性粒细胞白血病细胞(K562),观察其对K562细胞增殖与凋亡的影响。方法合成miR-203的前体序列,克隆至pLVX-IRES-ZsGreen1载体中构建成重组慢病毒质粒pLVX-shRNA2-miR-203(PremiR-203)。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体将其与包装质粒PLD2及包膜质粒PLD3共转染293T和K562细胞。荧光显微镜观察293T和K562细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达。QRT-PCR检测miR-203在K562细胞中的表达水平,MTT实验检测对K562细胞增殖的影响,流式细胞术分析细胞周期,TUNEL染色观察细胞凋亡形态。采用完全随机设计的单因素方差分析组间差异的显著性。结果经酶切鉴定和核酸序列测定,293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带miR-203基因的重组慢病毒,滴度为1.2×108 TU/mL。重组慢病毒感染K562细胞后,细胞中miR-203基因呈高表达;PremiR-203对K562细胞增殖抑制率24h为(8.10±0.15)%,高于阴性对照组的(5.16±0.14)%,F=3 499.1,P<0.001;48h为(32.4±0.49)%,明显高于阴性对照组的(6.4±0.19)%,F=9439.3,P<0.001;72h为(59.0±0.53)%,F=32 865.16,P<0.001。流式细胞术结果显示,细胞周期比例G1期为38%,S期为54%,G2期为8%。荧光显微镜观察到细胞核碎裂、核质固缩、细胞膜突出等典型的凋亡形态。结论成功构建重组慢病毒介导hsa-miR-203的表达载体,实现了其在细胞中的稳定表达,并有效抑制K562细胞增殖,并促进细胞凋亡。
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