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摘要：【目的】明確石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）主要衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）的生物学功能，为阐明SGIV感染致病机理及研发抗病毒产品提供理论依据。【方法】使用实时荧光定量PCR检测SGIV感染过程中MCP基因的转录时序及其在SGIV感染石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中的表达水平;将SGIV MCP基因分别克隆至真核表达载体pEGFP-N3和pcDNA3.1上，构建重组质粒pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP，然后以重组质粒pEGFP-N3-MCP转染石斑鱼脾细胞（Grouper spleen cell，GS）进行亚细胞定位分析，同时以重组质粒pcDNA3.1-MCP转染胖头鲤细胞（Fathead minnow cells，FHM）构建能稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系（FHM-MCP），用于分析MCP蛋白对宿主细胞生长增殖及SGIV感染压力下细胞存活率和病毒复制的影响。【结果】在SGIV感染8 h后即可检测到MCP基因的特异性转录，即MCP基因是一个晚期基因。在SGIV感染24 h后，MCP基因在石斑鱼脾脏中的相对表达量最高，其次是在肝脏、肾脏和肠道组织中，而在胃和鳃组织中的相对表达量较低，提示胃和鳃组织并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV的MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中。细胞生长增殖曲线和细胞计数结果均证实，MCP蛋白能调节细胞生长及促进细胞分裂增殖。在SGIV感染后24和48 h，FHM-MCP细胞的存活率均显著高于FHM-Vector细胞（真核表达载体pcDNA3.1转染FHM细胞），其存活率分别是FHM-Vector细胞的1.12和1.15倍。此外，FHM-MCP细胞在SGIV感染24和48 h后，其病毒滴度均高于FHM-Vector细胞，即MCP蛋白能促进SGIV病毒复制。【结论】SGIV的MCP基因是一个晚期基因，其编码蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中，通过促进宿主细胞分裂增殖及病毒复制，最终提高SGIV的病毒滴度和感染力。
关键词： 石斑鱼虹彩病毒（SGIV）;主要衣壳蛋白（MCP）;表达分析;亚细胞定位;宿主细胞
中图分类号： S941.41 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）03-0806-09
Expression and biological functional analysis of major capsid protein （MCP） of Singapore grouper iridovirus
XIAO He-he1，2， XU Feng-qiao1，3， LIU Ming-zhu1， SU Mei-zhen1，2，
YU Qing1， LI Meng-meng4， LI Peng-fei1，3*
（1Guangxi Academy of Sciences/Guangxi Fishery Major Diseases Control and Efficient Breeding Technology Research Center/Guangxi Key Laboratory of Marine Natural Products and Combinatorial Biosynthesis Chemistry， Nanning 530007， China; 2College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University/Key Laborratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shanghai 201306， China; 3College of Marine Sciences， Beibu Gulf University/Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation， Qinzhou， Guangxi 535011， China; 4College of Life Science， Henan Normal University， Xinxiang， Henan 453007， China）
Abstract：【Objective】The biological function of major capsid protein（MCP） of Singapore grouper iridovirus（SGIV） was analyzed in this study， which could provide data support and theoretical basis for elucidating the pathogenic mechanism of SGIV infection and developing antiviral products. 【Method】Real-time fluorescence quantitative PCR was used to perform the transcriptional analysis of MCP gene， and identify the expression of MCP in the spleen， liver， kidney， intestine， stomach and gill tissues of grouper during SGIV infection. SGIV MCP genes were cloned into eukaryotic expression vectors pEGFP-N3 and pcDNA3.1， respectively， to construct the recombinant plasmids pEGFP-N3-MCP and pcDNA3.1-MCP. Then pEGFP-N3-MCP was transfected into grouper spleen cells （GS） for subcellular localization analysis. At the same time， the recombinant plasmid pcDNA3.1-MCP was transfected into fathead minnow cells （FHM） to construct a FHM cell line（FHM-MCP） capable of stably expressing MCP protein， which was used to analyze the effects of MCP protein on host cell growth and proliferation and effects of on cell survival rates and viral replication during SGIV infection. 【Result】The specific transcription of MCP gene could be detected 8 h after SGIV infection， which meaned that MCP gene was a late gene. After 4 h of SGIV infection， the expression of MCP gene was the highest in spleen， followed by liver， kidney and intestine， however， the relative expression levels in stomach and gill tissues were low， suggesting that stomach and gill tissues were not the main target organs for SGIV infection. Subcellular localization results showed that MCP proteins of SGIV were mainly located in the cytoplasm near the nucleus. Both cell growth curve and cell count results were confirmed that MCP protein could regulate cell growth and promote cell proliferation. At 24 and 48 h after SGIV infection， the survival rate of FHM cells overexpressing MCP gene（FHM-MCP） was significantly higher than that of FHM-Vector cells （transfected with eukaryotic expression vector pcDNA3.1）， and the survival rate was as 1.12 and 1.15 times as that of FHM-Vector cells， respectively. Furthermore， the virus titers of FHM-MCP cells were higher than FHM-Vector cells 24 and 48 h after SGIV infection， that was， overexpression of MCP protein could promote virus replication after SGIV infection. 【Conclusion】SGIV MCP gene is a late gene， and its encoded protein is mainly located in the cytoplasm near the nucleus. By promoting the division and proliferation of host cells and virus replication， it ultimately improves the virus titer and infectivity of SGIV. Key words： Singapore grouper iridovirus（SGIV）; major capsid protein（MCP）; expression analysis; subcellular localization; host cell
Foundation item： National Natural Science Foundation of China（41706145）; Guangxi Key Research and Development Project（GuikeAB18221111）; Natural Science Foundation of Guangxi（2019GXNSFAA245054，AD19245022）
0 引言
【研究意义】虹彩病毒（Iridovirus）是目前公认严重危害海水和淡水养殖鱼类的传染性病原之一，石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）是从患病石斑鱼中分离获得的高致病性虹彩病毒（Qin et al.，2003），可导致石斑鱼发病死亡率在90%以上，给石斑鱼养殖产业带来严重的经济损失（关丽雅等，2013）。主要衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）是虹彩病毒粒子的主要结构蛋白，具有多种生物学功能，在病毒的包装和感染过程中发挥重要作用（Ouyang et al.，2012;Yan et al.，2015;周小愿等，2016），尤其是病毒的抗原相关蛋白已成为设计和制备抗病毒药物及疫苗的关键靶标（苗素英等，2001）。因此，明确MCP的转录时序、亚细胞定位、调控细胞周期作用及其对SGIV复制的影响，可为揭示SGIV感染致病分子机理提供理论依据。【前人研究进展】石斑鱼是我国南方沿海地区及东南亚国家重要的海水养殖鱼类之一，其经济价值极高（王大鹏等，2012;余庆等，2019;张显良等，2019）。但在高密度养殖条件下，各种水产疫病频繁暴发，严重制约了石斑鱼养殖业的持续健康发展（饶颖竹等，2016;李鹏飞等，2018，2019;Xiao et al.，2019;Yu et al.，2019b）。其中，SGIV是最主要的病毒性疫病病原之一，最早由Qin等（2003）从患病石斑鱼中分离获得，通过序列比对证实SGIV隶属于蛙虹彩病毒属。2017年出版的《国际病毒分类手册》（第10版）正式将SGIV确定为蛙病毒属的1个新种（Qin et al.，2003;Chinchar et al.，2017）。SGIV呈正二十面体结构，其直径介于154～176 nm，纯化的SGIV颗粒具有双层膜结构，包括最外层的脂蛋白囊膜和最内层的脂质膜。双层膜包围着1个约90 nm的电子致密核，含有双链DNA;囊膜与脂质膜间为规律排列的蛋白质衣壳，由衣壳亚单位紧密连接形成（秦启伟和黄晓红，2019）。MCP是虹彩病毒的核心蛋白，其分子量约50 kD，占整个病毒蛋白的40%～45%，约占病毒可溶性蛋白的90%（萧枫和张奇亚，2004;Zhao et al.，2007）。MCP基因在虹彩病毒科同属间高度保守，不同属间差异显著，是研究虹彩病毒分类及系统演变的重要靶基因（Song et al.，2004;Whittington et al.，2010）。MCP也是研究病毒感染機制的重要抗原相关蛋白。Caipang等（2006）基于MCP基因构建红鲷虹膜病毒（RSIV）DNA疫苗，并证实其对红鲷具有良好的免疫保护作用，免疫红鲷群体的相对存活率（RPS）介于42.8%～71.4%，显著高于对照组，即构建的DNA疫苗能诱导鱼类产生抗RSIV感染的强大保护作用。曾宪辉等（2015）将MCP基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建大鲵虹彩病毒MCP基因DNA疫苗表达载体，并探究DNA疫苗免疫对大鲵的保护效果，结果表明该DNA疫苗可诱导大鲵产生较强的细胞免疫活性，同时刺激机体产生特异性抗体。【本研究切入点】MCP作为虹彩病毒的主要结构蛋白，在病毒组装合成及其侵染过程中发挥重要作用（Ou-yang et al.，2012;Yan et al.，2015;周小愿等，2016），但针对SGIV MCP的研究至今鲜见报道。【拟解决的关键问题】从SGIV的基因组中克隆MCP基因，并研究分析其转录时序、亚细胞定位、调控细胞周期作用及其对SGIV复制的影响，旨在明确MCP的生物学功能，为阐明SGIV感染致病机理及研发抗病毒产品提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
SGIV广西株由广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室保存提供（Xiao et al.，2019）;石斑鱼脾脏组织细胞系（Grouper spleen cell，GS）和胖头鲤细胞（Fathead minnow cells，FHM）由广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室建立并保存提供;胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司;PCR纯化回收试剂盒、凝胶回收试剂盒、去内毒素质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker、限制性内切酶及pMD19-T载体等购自TakaRa公司;真核表达载体pEGFP-N3和pcDNA3.1、表达菌株DH5α和Rosetta（DE3）购自Novagen公司;转染试剂LipofectamineTM 3000购自赛默飞世尔科技公司;G418购自美国Sigma-Aldrich公司;细胞培养瓶、波点皿及细胞培养板购自美国Corning公司。
1. 2 SGIV感染过程中MCP基因的转录时序
将2.0×105个GS细胞接入12孔板，28 ℃培养18 h，然后将SGIV（MOI=1）接入GS细胞中，28 ℃继续培养，分别于接种SGIV后2、4、8、12、16、24和48 h时收集12孔板中的GS细胞及其培养基。采用RNA提取试剂盒提取SGIV感染的GS细胞总RNA，并反转录合成cDNA;然后以cDNA为模板、β-actin为内参基因，利用实时荧光定量PCR检测MCP基因（ORF072）的转录情况。以正常GS细胞为对照处理，每处理设3个重复（余庆等，2020）。实时荧光定量PCR检测MCP基因的引物见表1。 1. 3 SGIV感染过程中MCP基因在不同组织中的表达情况
为阐明SGIV感染过程中MCP基因在不同组织中的表达情况，采用实时荧光定量PCR分别检测SGIV感染石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中MCP基因的相对表达量。取体长约10 cm的石斑鱼，空腹24 h后腹腔注射100 μL SGIV（106 TCID50/mL），分别于攻毒后12和24 h剖解取样，以健康石斑鱼为对照。使用RNA提取试剂盒提取总RNA，并反转录合成cDNA;然后以cDNA为模板、β-actin基因为内参基因，采用实时荧光定量PCR检测MCP基因的表达情况。每处理设3个重复。
1. 4 重组质粒构建
SGIV MCP基因（ORF072）（GenBank登录号YP_ 164167.1;核苷酸位置66404～67795 nt）全长1392 bp，共编码463个氨基酸残基，根据MCP基因核苷酸全长序列设计相应的特异性扩增引物。同时根据pEGFP-N3绿色荧光质粒图谱在上、下游引物分别引入EcoR I和BamH I酶切位点，根据pcDNA3.1质粒图谱在上、下游引物分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。以SGIV基因组DNA为模板进行PCR扩增，利用PCR纯化回收试剂盒收集PCR扩增片段，使用相应的限制性内切酶分别对纯化回收的PCR片段和真核表达载体进行双酶切，T4连接酶16 ℃连接过夜，然后转化DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜。经菌落PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆送至武汉金开瑞生物工程有限公司测序，对测序结果正确的菌液进行PCR扩增，并以去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒，构建成功的重组质粒分别命名为pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP。
1. 5 亚细胞定位分析
将1.0×104个GS细胞接入细胞波点皿，28 ℃培养18 h。将重组质粒pEGFP-N3-MCP转染至GS细胞中，28 ℃继续培养24 h，然后于4 ℃下以4%多聚甲醛固定細胞2 h，经Hoechst33342室温染色3 min，再用PBS轻轻漂洗细胞3次，略干燥后用抗荧光淬灭剂封片，使用激光共聚焦显微镜对各组细胞进行荧光观察。以真核表达载体pEGFP-N3转染的GS细胞为对照。
1. 6 稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系构建
将2.0×105个FHM细胞接入12孔板，28 ℃培养18 h，分别以重组质粒pcDNA3.1-MCP和真核表达载体pcDNA3.1转染FHM细胞，28 ℃继续培养24 h。以胰酶对细胞进行消化处理，将细胞加入含400 μg/mL G418的细胞培养基中，混匀，然后接入12孔板，28 ℃继续培养。每4 d传代一次，待细胞在G418压力下不再死亡且正常生长后，转移至细胞培养瓶中继续传代培养，细胞系分别命名为FHM-MCP和FHM-Vector。收集细胞并提取其总RNA，反转录合成cDNA;并以cDNA为模板，使用MCP基因引物检测目的基因。
1. 7 MCP蛋白对细胞生长增殖的影响
将2.0×105个FHM-MCP细胞接入24孔板，28 ℃培养，分别于培养24、48和72 h时检测细胞数量，绘制细胞生长增殖曲线。参照Li等（2015）的方法，使用CCK-8溶液检测细胞活力变化。具体操作：将1.0×104个FHM-MCP细胞接入96孔板，28 ℃继续培养，分别于培养24、48和72 h时向96孔板的各孔中加入10 ?L CCK-8溶液，室温孵育4 h，利用酶标仪检测450 nm处的吸光值，绘制细胞生长增殖曲线。以FHM-Vector细胞为对照。各组细胞均设3个重复。
1. 8 MCP蛋白对SGIV感染细胞存活率的影响
将1.0×104个FHM-MCP细胞和FHM-Vector细胞分别接入96孔板，28 ℃培养18 h;然后将SGIV（MOI=1）接入细胞中，28 ℃继续培养，分别于攻毒后24、48和72 h时向各孔中加入10 ?L CCK-8溶液，室温孵育4 h后，利用酶标仪检测450 nm处的吸光值，以检测细胞活性，各组细胞均设3个重复。以正常培养的FHM-Vector细胞为对照。将测得的吸光值代入如下公式（1），计算各组细胞的存活率（Survival rate，SR）（余庆等，2020）：
SR（%）=OD450 nm（SGIV攻毒组）/OD450 nm（FHM-Vector）×100 （1）
1. 9 MCP蛋白对SGIV复制增殖的影响
将2.0×105个FHM-MCP细胞接入12孔板，28 ℃培养18 h;然后将SGIV（MOI=1）接入细胞中，28 ℃继续培养48 h。以SGIV（MOI=1）感染的FHM-Vector细胞为对照组。分别于攻毒后12、24和48 h时收集12孔板中的细胞及其培养基，各样品经-80 ℃反复冻融3次后，梯度稀释并接入96孔板的FHM细胞中，利用TCID50法计算病毒滴度。
2 结果与分析
2. 1 SGIV MCP基因的转录时序分析结果
为分析SGIV MCP基因的转录时序，分别收集病毒感染0、2、4、8、12、16、24和48 h后的GS细胞，提取细胞总RNA，并以反转录合成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，结果（图1）显示，在SGIV感染8 h后即可检测到MCP基因的特异性转录，进一步证实MCP基因是一个晚期基因。
2. 2 SGIV感染过程中MCP基因在石斑鱼不同组织中的表达情况
采用实时荧光定量PCR检测SGIV感染过程中MCP基因在石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中的表达情况。如图2所示，对石斑鱼腹腔注射SGIV后，MCP基因的转录表达持续升高;至攻毒24 h后MCP基因在脾脏中的相对表达量最高，其次是在肝脏、肾脏和肠道组织中，而在胃和鳃组织中MCP基因的相对表达量较低，提示胃和鳃组织可能并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV主要感染脾脏、肝脏、肾脏和肠道等靶器官的上皮和内皮细胞（Huang et al.，2004）。 2. 3 SGIV MCP蛋白的亚细胞定位分析结果
为探究SGIV MCP蛋白在细胞内的定位情况，以重组质粒pEGFP-N3-MCP及真核表达载体pEGFP-N3分别转染GS细胞，结果显示，与真核表达载体pEGFP-N3转染全细胞分布的定位特征不同，SGIV MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中（图3）。SGIV主要在宿主细胞质中完成自组装，MCP蛋白是构成SGIV核衣壳的主要结构蛋白，核衣壳以晶体排列方式存在于细胞核附近的病毒加工厂，电子致密核进入核衣壳中形成成熟的完整病毒核衣壳，最终完成病毒装配及释放等侵染过程（秦启伟和黄晓红，2019;Yu et al.，2019a）。
2. 4 稳定表达MCP蛋白FHM细胞的构建情况
为深入研究SGIV MCP蛋白的生物学功能，以重组质粒pcDNA3.1-MCP转染FHM细胞，构建能稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系（FHM-MCP）;以真核表达载体pcDNA3.1转染的FHM细胞（FHM-Vector）为对照。提取稳定转染细胞总RNA，并以反转录合成的cDNA为模版，使用MCP基因特异引物进行PCR扩增，以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图4所示，FHM-MCP细胞出现单一的条带，且PCR扩增产物大小与编码MCP蛋白的MCP基因（约1400 bp）一致;而FHM-Vector细胞未检出任何条带。可见，FHM-MCP细胞已构建成功。
2. 5 MCP蛋白能促进FHM细胞分裂增殖
已有研究表明，一些病毒编码的蛋白具有促进细胞分裂增殖及促进细胞生长的作用，如SGIV的VP51、ICP18和VP96等（Xia et al.，2009，2010;Yu et al.，2016）。为验证SGIV MCP蛋白是否具有类似功能，使用稳定表达MCP蛋白的FHM-MCP细胞进行增殖试验，以CCK-8测定细胞活力，并绘制细胞生长增殖曲线，结果显示，MCP蛋白可有效促进FHM细胞增殖（图5），且细胞计数进一步证实MCP蛋白能调节细胞生长及促进细胞分裂增殖（图6）。
2. 6 MCP蛋白能提高SGIV感染细胞存活率及促进病毒复制
SGIV感染FHM细胞会引起典型的凋亡反应，导致细胞存活率下降（Huang et al.，2011）。为进一步阐明MCP蛋白的功能，检测FHM-MCP细胞在SGIV感染压力下的存活率变化。如图7所示，在SGIV感染后12 h，FHM-MCP细胞的存活率与对照组FHM-Vector细胞无显著差异（P>0.05）;在SGIV感染后24和48 h，FHM-MCP细胞的存活率均显著高于对照组FHM-Vector细胞（P<0.05，下同），且FHM-MCP细胞在SGIV感染后24和48 h的存活率分别是FHM-Vector细胞的1.12和1.15倍。为揭示MCP对病毒复制的影响，采用TCID50法计算FHM-MCP细胞在SGIV感染压力下的滴度变化，结果（图8）显示，FHM-MCP细胞在SGIV感染后24和48 h，其病毒滴度均显著高于FHM-Vector细胞，说明MCP蛋白能促进SGIV病毒复制。
3 讨论
病毒侵染宿主细胞起始于病毒与细胞表面受体的接触结合，病毒在受体介导下进入宿主细胞，并在细胞内开始复制、组装和释放，而完成完整的侵染周期。在此过程中，病毒为了保证顺利完成复制、装配和传播等过程，会编码多种蛋白发挥调控作用（秦启伟和黄晓红，2019）。因此，深入开展病毒侵染宿主的基因组学、转录组学和蛋白组学等研究，可为阐明病毒侵入宿主细胞的分子机制及研发高效的靶向抗病毒药物和免疫防控产品提供参考依据。SGIV具有双链环状DNA，目前已有针对SGIV基因组学、转录组学和蛋白组学等的系统研究，相关结论部分揭示了SGIV的侵染致病机理。SGIV基因组全长140131 bp，共编码162个开放阅读框（ORF），而编码ORF的基因根据转录表达先后顺序又可被分為立即早期基因（Immediate-early，IE）、早期基因（Early，E）和晚期基因（Late，L）（Song et al.，2004）。SGIV在体外感染宿主细胞中存在15个IE转录本、89个E转录本及53个L转录本。ORF086R和ORF162L属于立即早期基因，二者的转录表达产物能促进细胞生长及促进SGIV复制;ORF016L、ORF019R、ORF088L和ORF039L属于晚期基因，能编码病毒囊膜蛋白。值得注意的是：在细胞系水平和鱼活体水平，SGIV感染的基因转录模式差异明显，尤其是在鱼活体水平SGIV感染的基因转录模式更复杂。为了抵抗病毒感染，宿主通过抑制与病毒复制有关的IE转录本和E转录本以干扰病毒复制，最终实现对病毒的免疫清除（秦启伟和黄晓红，2019）。本研究通过分析SGIV MCP基因转录时序，证实MCP基因是一个晚期基因，其编码MCP蛋白是构成SGIV核衣壳的主要结构蛋白（Song et al.，2004），与针对大鲵虹彩病毒的研究结果（Chinchar et al.，2011;周小愿等，2016）一致。
最新研究结果显示，除了非结构蛋白，病毒的结构蛋白也能在病毒的侵染及复制过程中发挥重要调控作用（Yu et al.，2016;Lu et al.，2017）。草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）的外衣壳蛋白VP5作为重要的结构蛋白，能与VP7结合形成三聚体复合物，进而在GCRV表面构成三聚体网络，以保护病毒粒子及维持病毒结构稳定（Fang et al.，2005）。此外，VP5能与宿主细胞膜上的层黏连蛋白（LamR）发生相互作用，进而介导GCRV吸附和侵入宿主细胞（Wang et al.，2016）。据报道，SGIV的外衣壳通过与宿主细胞膜相互作用，而介导病毒侵染进入宿主细胞;随后病毒在细胞内的复制促使病毒组装位点（Viral assembly site，VAS）形成，此时作为前体出现的膜结构通过招募衣壳蛋白，形成双壳新月形结构，进而形成二十面体衣壳。在此过程中，若抑制MCP蛋白表达，可有效阻断病毒衣壳形成（Liu et al.，2016）。本研究发现，虽然MCP基因在SGIV感染后8 h即出现少量表达，且随时间延长其转录表达水平持续增加，但MCP基因的转录表达在SGIV感染后8～16 h增加趋势较缓慢，直至感染24 h后其转录表达水平才显著增高，故推测前期少量表达的MCP蛋白可能对宿主细胞发挥部分调控功能，而后期大量表达的MCP蛋白主要参与SGIV的组装。 明确病毒蛋白在细胞内的定位可为其功能研究提供极具价值的思路与线索。本研究通过体外转染表达MCP融合蛋白，观察绿色荧光的分布情况以判定MCP蛋白的亚细胞定位，结果表明，SGIV MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中。说明SGIV主要在宿主细胞核附近的病毒加工厂中进行组装，而MCP蛋白正是构成其核衣壳的主要结构蛋白（秦启伟和黄晓红，2019）。也有研究显示，在SGIV感染宿主细胞的过程中，MCP蛋白会出现在细胞膜上。Yu等（2019a）利用特异性识别SGIV侵染宿主细胞的核酸适配体Q5，通过微纳米磁珠—磁性分离技术和质谱技术对核酸适配体的靶标蛋白进行分离、富集与鉴定，证明核酸适配体Q5在SGIV感染细胞上的靶标蛋白即为MCP蛋白。该研究成果首次证明SGIV在侵染过程中其MCP蛋白可能会出现在细胞膜上（Li et al.，2015;Yu et al.，2019a）。为进一步探究MCP蛋白影响SGIV侵染宿主细胞的作用机制，Yu等（2020）利用核酸适配体Q5构建了高特异性的荧光分子探针，并通过Q5荧光探针研究MCP蛋白在病毒感染宿主内的转运机制，证实MCP蛋白进入宿主细胞不依赖于网格蛋白介导的内吞途径，也不依赖于巨胞饮途径，而是主要依赖小窝蛋白介导的内吞途径，同时需要发动蛋白（Dynamin）参与，且依赖于低pH条件和细胞骨架微丝。该结论不仅从崭新的角度阐明SGIV侵染致病的分子机理及MCP蛋白的作用机制，还为从活细胞水平研究病毒生命活动提供理想的病毒—细胞模型和探针工具，进而为研发有效的抗病毒手段提供新思路。
病毒在侵染过程中会编码一些基因以调节细胞周期，影响宿主细胞的分裂增殖，最终促进病毒复制（Xia et al.，2009，2010）。人类巨细胞病毒会通过US27基因产物调控细胞周期及增强细胞增殖（La-res et al.，2013）。SGIV的ORF51基因能转录表达肿瘤坏死因子受体（TNFR）类似物，可有效调节细胞生长及促进病毒复制（Yu et al.，2016）。本研究也发现，SGIV的MCP基因不仅能促进细胞分裂增殖，还可提高SGIV感染压力下的细胞存活率。故推测MCP蛋白在SGIV的侵染过程中对宿主细胞生长具有一定调节作用，能促使SGIV更有效地完成复制，最终提高病毒滴度和病毒感染力。
4 结论
SGIV的MCP基因是一个晚期基因，其编码蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中，通过促进宿主细胞分裂增殖及病毒复制，最终提高SGIV的病毒滴度和感染力。
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（責任编辑 兰宗宝）
关键词： 石斑鱼虹彩病毒（SGIV）;主要衣壳蛋白（MCP）;表达分析;亚细胞定位;宿主细胞
中图分类号： S941.41 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）03-0806-09
Expression and biological functional analysis of major capsid protein （MCP） of Singapore grouper iridovirus
XIAO He-he1，2， XU Feng-qiao1，3， LIU Ming-zhu1， SU Mei-zhen1，2，
YU Qing1， LI Meng-meng4， LI Peng-fei1，3*
（1Guangxi Academy of Sciences/Guangxi Fishery Major Diseases Control and Efficient Breeding Technology Research Center/Guangxi Key Laboratory of Marine Natural Products and Combinatorial Biosynthesis Chemistry， Nanning 530007， China; 2College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University/Key Laborratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shanghai 201306， China; 3College of Marine Sciences， Beibu Gulf University/Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation， Qinzhou， Guangxi 535011， China; 4College of Life Science， Henan Normal University， Xinxiang， Henan 453007， China）
Abstract：【Objective】The biological function of major capsid protein（MCP） of Singapore grouper iridovirus（SGIV） was analyzed in this study， which could provide data support and theoretical basis for elucidating the pathogenic mechanism of SGIV infection and developing antiviral products. 【Method】Real-time fluorescence quantitative PCR was used to perform the transcriptional analysis of MCP gene， and identify the expression of MCP in the spleen， liver， kidney， intestine， stomach and gill tissues of grouper during SGIV infection. SGIV MCP genes were cloned into eukaryotic expression vectors pEGFP-N3 and pcDNA3.1， respectively， to construct the recombinant plasmids pEGFP-N3-MCP and pcDNA3.1-MCP. Then pEGFP-N3-MCP was transfected into grouper spleen cells （GS） for subcellular localization analysis. At the same time， the recombinant plasmid pcDNA3.1-MCP was transfected into fathead minnow cells （FHM） to construct a FHM cell line（FHM-MCP） capable of stably expressing MCP protein， which was used to analyze the effects of MCP protein on host cell growth and proliferation and effects of on cell survival rates and viral replication during SGIV infection. 【Result】The specific transcription of MCP gene could be detected 8 h after SGIV infection， which meaned that MCP gene was a late gene. After 4 h of SGIV infection， the expression of MCP gene was the highest in spleen， followed by liver， kidney and intestine， however， the relative expression levels in stomach and gill tissues were low， suggesting that stomach and gill tissues were not the main target organs for SGIV infection. Subcellular localization results showed that MCP proteins of SGIV were mainly located in the cytoplasm near the nucleus. Both cell growth curve and cell count results were confirmed that MCP protein could regulate cell growth and promote cell proliferation. At 24 and 48 h after SGIV infection， the survival rate of FHM cells overexpressing MCP gene（FHM-MCP） was significantly higher than that of FHM-Vector cells （transfected with eukaryotic expression vector pcDNA3.1）， and the survival rate was as 1.12 and 1.15 times as that of FHM-Vector cells， respectively. Furthermore， the virus titers of FHM-MCP cells were higher than FHM-Vector cells 24 and 48 h after SGIV infection， that was， overexpression of MCP protein could promote virus replication after SGIV infection. 【Conclusion】SGIV MCP gene is a late gene， and its encoded protein is mainly located in the cytoplasm near the nucleus. By promoting the division and proliferation of host cells and virus replication， it ultimately improves the virus titer and infectivity of SGIV. Key words： Singapore grouper iridovirus（SGIV）; major capsid protein（MCP）; expression analysis; subcellular localization; host cell
Foundation item： National Natural Science Foundation of China（41706145）; Guangxi Key Research and Development Project（GuikeAB18221111）; Natural Science Foundation of Guangxi（2019GXNSFAA245054，AD19245022）
0 引言
【研究意义】虹彩病毒（Iridovirus）是目前公认严重危害海水和淡水养殖鱼类的传染性病原之一，石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）是从患病石斑鱼中分离获得的高致病性虹彩病毒（Qin et al.，2003），可导致石斑鱼发病死亡率在90%以上，给石斑鱼养殖产业带来严重的经济损失（关丽雅等，2013）。主要衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）是虹彩病毒粒子的主要结构蛋白，具有多种生物学功能，在病毒的包装和感染过程中发挥重要作用（Ouyang et al.，2012;Yan et al.，2015;周小愿等，2016），尤其是病毒的抗原相关蛋白已成为设计和制备抗病毒药物及疫苗的关键靶标（苗素英等，2001）。因此，明确MCP的转录时序、亚细胞定位、调控细胞周期作用及其对SGIV复制的影响，可为揭示SGIV感染致病分子机理提供理论依据。【前人研究进展】石斑鱼是我国南方沿海地区及东南亚国家重要的海水养殖鱼类之一，其经济价值极高（王大鹏等，2012;余庆等，2019;张显良等，2019）。但在高密度养殖条件下，各种水产疫病频繁暴发，严重制约了石斑鱼养殖业的持续健康发展（饶颖竹等，2016;李鹏飞等，2018，2019;Xiao et al.，2019;Yu et al.，2019b）。其中，SGIV是最主要的病毒性疫病病原之一，最早由Qin等（2003）从患病石斑鱼中分离获得，通过序列比对证实SGIV隶属于蛙虹彩病毒属。2017年出版的《国际病毒分类手册》（第10版）正式将SGIV确定为蛙病毒属的1个新种（Qin et al.，2003;Chinchar et al.，2017）。SGIV呈正二十面体结构，其直径介于154～176 nm，纯化的SGIV颗粒具有双层膜结构，包括最外层的脂蛋白囊膜和最内层的脂质膜。双层膜包围着1个约90 nm的电子致密核，含有双链DNA;囊膜与脂质膜间为规律排列的蛋白质衣壳，由衣壳亚单位紧密连接形成（秦启伟和黄晓红，2019）。MCP是虹彩病毒的核心蛋白，其分子量约50 kD，占整个病毒蛋白的40%～45%，约占病毒可溶性蛋白的90%（萧枫和张奇亚，2004;Zhao et al.，2007）。MCP基因在虹彩病毒科同属间高度保守，不同属间差异显著，是研究虹彩病毒分类及系统演变的重要靶基因（Song et al.，2004;Whittington et al.，2010）。MCP也是研究病毒感染機制的重要抗原相关蛋白。Caipang等（2006）基于MCP基因构建红鲷虹膜病毒（RSIV）DNA疫苗，并证实其对红鲷具有良好的免疫保护作用，免疫红鲷群体的相对存活率（RPS）介于42.8%～71.4%，显著高于对照组，即构建的DNA疫苗能诱导鱼类产生抗RSIV感染的强大保护作用。曾宪辉等（2015）将MCP基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建大鲵虹彩病毒MCP基因DNA疫苗表达载体，并探究DNA疫苗免疫对大鲵的保护效果，结果表明该DNA疫苗可诱导大鲵产生较强的细胞免疫活性，同时刺激机体产生特异性抗体。【本研究切入点】MCP作为虹彩病毒的主要结构蛋白，在病毒组装合成及其侵染过程中发挥重要作用（Ou-yang et al.，2012;Yan et al.，2015;周小愿等，2016），但针对SGIV MCP的研究至今鲜见报道。【拟解决的关键问题】从SGIV的基因组中克隆MCP基因，并研究分析其转录时序、亚细胞定位、调控细胞周期作用及其对SGIV复制的影响，旨在明确MCP的生物学功能，为阐明SGIV感染致病机理及研发抗病毒产品提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
SGIV广西株由广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室保存提供（Xiao et al.，2019）;石斑鱼脾脏组织细胞系（Grouper spleen cell，GS）和胖头鲤细胞（Fathead minnow cells，FHM）由广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室建立并保存提供;胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司;PCR纯化回收试剂盒、凝胶回收试剂盒、去内毒素质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker、限制性内切酶及pMD19-T载体等购自TakaRa公司;真核表达载体pEGFP-N3和pcDNA3.1、表达菌株DH5α和Rosetta（DE3）购自Novagen公司;转染试剂LipofectamineTM 3000购自赛默飞世尔科技公司;G418购自美国Sigma-Aldrich公司;细胞培养瓶、波点皿及细胞培养板购自美国Corning公司。
1. 2 SGIV感染过程中MCP基因的转录时序
将2.0×105个GS细胞接入12孔板，28 ℃培养18 h，然后将SGIV（MOI=1）接入GS细胞中，28 ℃继续培养，分别于接种SGIV后2、4、8、12、16、24和48 h时收集12孔板中的GS细胞及其培养基。采用RNA提取试剂盒提取SGIV感染的GS细胞总RNA，并反转录合成cDNA;然后以cDNA为模板、β-actin为内参基因，利用实时荧光定量PCR检测MCP基因（ORF072）的转录情况。以正常GS细胞为对照处理，每处理设3个重复（余庆等，2020）。实时荧光定量PCR检测MCP基因的引物见表1。 1. 3 SGIV感染过程中MCP基因在不同组织中的表达情况
为阐明SGIV感染过程中MCP基因在不同组织中的表达情况，采用实时荧光定量PCR分别检测SGIV感染石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中MCP基因的相对表达量。取体长约10 cm的石斑鱼，空腹24 h后腹腔注射100 μL SGIV（106 TCID50/mL），分别于攻毒后12和24 h剖解取样，以健康石斑鱼为对照。使用RNA提取试剂盒提取总RNA，并反转录合成cDNA;然后以cDNA为模板、β-actin基因为内参基因，采用实时荧光定量PCR检测MCP基因的表达情况。每处理设3个重复。
1. 4 重组质粒构建
SGIV MCP基因（ORF072）（GenBank登录号YP_ 164167.1;核苷酸位置66404～67795 nt）全长1392 bp，共编码463个氨基酸残基，根据MCP基因核苷酸全长序列设计相应的特异性扩增引物。同时根据pEGFP-N3绿色荧光质粒图谱在上、下游引物分别引入EcoR I和BamH I酶切位点，根据pcDNA3.1质粒图谱在上、下游引物分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。以SGIV基因组DNA为模板进行PCR扩增，利用PCR纯化回收试剂盒收集PCR扩增片段，使用相应的限制性内切酶分别对纯化回收的PCR片段和真核表达载体进行双酶切，T4连接酶16 ℃连接过夜，然后转化DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜。经菌落PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆送至武汉金开瑞生物工程有限公司测序，对测序结果正确的菌液进行PCR扩增，并以去内毒素质粒提取试剂盒提取去内毒素质粒，构建成功的重组质粒分别命名为pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP。
1. 5 亚细胞定位分析
将1.0×104个GS细胞接入细胞波点皿，28 ℃培养18 h。将重组质粒pEGFP-N3-MCP转染至GS细胞中，28 ℃继续培养24 h，然后于4 ℃下以4%多聚甲醛固定細胞2 h，经Hoechst33342室温染色3 min，再用PBS轻轻漂洗细胞3次，略干燥后用抗荧光淬灭剂封片，使用激光共聚焦显微镜对各组细胞进行荧光观察。以真核表达载体pEGFP-N3转染的GS细胞为对照。
1. 6 稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系构建
将2.0×105个FHM细胞接入12孔板，28 ℃培养18 h，分别以重组质粒pcDNA3.1-MCP和真核表达载体pcDNA3.1转染FHM细胞，28 ℃继续培养24 h。以胰酶对细胞进行消化处理，将细胞加入含400 μg/mL G418的细胞培养基中，混匀，然后接入12孔板，28 ℃继续培养。每4 d传代一次，待细胞在G418压力下不再死亡且正常生长后，转移至细胞培养瓶中继续传代培养，细胞系分别命名为FHM-MCP和FHM-Vector。收集细胞并提取其总RNA，反转录合成cDNA;并以cDNA为模板，使用MCP基因引物检测目的基因。
1. 7 MCP蛋白对细胞生长增殖的影响
将2.0×105个FHM-MCP细胞接入24孔板，28 ℃培养，分别于培养24、48和72 h时检测细胞数量，绘制细胞生长增殖曲线。参照Li等（2015）的方法，使用CCK-8溶液检测细胞活力变化。具体操作：将1.0×104个FHM-MCP细胞接入96孔板，28 ℃继续培养，分别于培养24、48和72 h时向96孔板的各孔中加入10 ?L CCK-8溶液，室温孵育4 h，利用酶标仪检测450 nm处的吸光值，绘制细胞生长增殖曲线。以FHM-Vector细胞为对照。各组细胞均设3个重复。
1. 8 MCP蛋白对SGIV感染细胞存活率的影响
将1.0×104个FHM-MCP细胞和FHM-Vector细胞分别接入96孔板，28 ℃培养18 h;然后将SGIV（MOI=1）接入细胞中，28 ℃继续培养，分别于攻毒后24、48和72 h时向各孔中加入10 ?L CCK-8溶液，室温孵育4 h后，利用酶标仪检测450 nm处的吸光值，以检测细胞活性，各组细胞均设3个重复。以正常培养的FHM-Vector细胞为对照。将测得的吸光值代入如下公式（1），计算各组细胞的存活率（Survival rate，SR）（余庆等，2020）：
SR（%）=OD450 nm（SGIV攻毒组）/OD450 nm（FHM-Vector）×100 （1）
1. 9 MCP蛋白对SGIV复制增殖的影响
将2.0×105个FHM-MCP细胞接入12孔板，28 ℃培养18 h;然后将SGIV（MOI=1）接入细胞中，28 ℃继续培养48 h。以SGIV（MOI=1）感染的FHM-Vector细胞为对照组。分别于攻毒后12、24和48 h时收集12孔板中的细胞及其培养基，各样品经-80 ℃反复冻融3次后，梯度稀释并接入96孔板的FHM细胞中，利用TCID50法计算病毒滴度。
2 结果与分析
2. 1 SGIV MCP基因的转录时序分析结果
为分析SGIV MCP基因的转录时序，分别收集病毒感染0、2、4、8、12、16、24和48 h后的GS细胞，提取细胞总RNA，并以反转录合成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，结果（图1）显示，在SGIV感染8 h后即可检测到MCP基因的特异性转录，进一步证实MCP基因是一个晚期基因。
2. 2 SGIV感染过程中MCP基因在石斑鱼不同组织中的表达情况
采用实时荧光定量PCR检测SGIV感染过程中MCP基因在石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中的表达情况。如图2所示，对石斑鱼腹腔注射SGIV后，MCP基因的转录表达持续升高;至攻毒24 h后MCP基因在脾脏中的相对表达量最高，其次是在肝脏、肾脏和肠道组织中，而在胃和鳃组织中MCP基因的相对表达量较低，提示胃和鳃组织可能并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV主要感染脾脏、肝脏、肾脏和肠道等靶器官的上皮和内皮细胞（Huang et al.，2004）。 2. 3 SGIV MCP蛋白的亚细胞定位分析结果
为探究SGIV MCP蛋白在细胞内的定位情况，以重组质粒pEGFP-N3-MCP及真核表达载体pEGFP-N3分别转染GS细胞，结果显示，与真核表达载体pEGFP-N3转染全细胞分布的定位特征不同，SGIV MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中（图3）。SGIV主要在宿主细胞质中完成自组装，MCP蛋白是构成SGIV核衣壳的主要结构蛋白，核衣壳以晶体排列方式存在于细胞核附近的病毒加工厂，电子致密核进入核衣壳中形成成熟的完整病毒核衣壳，最终完成病毒装配及释放等侵染过程（秦启伟和黄晓红，2019;Yu et al.，2019a）。
2. 4 稳定表达MCP蛋白FHM细胞的构建情况
为深入研究SGIV MCP蛋白的生物学功能，以重组质粒pcDNA3.1-MCP转染FHM细胞，构建能稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系（FHM-MCP）;以真核表达载体pcDNA3.1转染的FHM细胞（FHM-Vector）为对照。提取稳定转染细胞总RNA，并以反转录合成的cDNA为模版，使用MCP基因特异引物进行PCR扩增，以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图4所示，FHM-MCP细胞出现单一的条带，且PCR扩增产物大小与编码MCP蛋白的MCP基因（约1400 bp）一致;而FHM-Vector细胞未检出任何条带。可见，FHM-MCP细胞已构建成功。
2. 5 MCP蛋白能促进FHM细胞分裂增殖
已有研究表明，一些病毒编码的蛋白具有促进细胞分裂增殖及促进细胞生长的作用，如SGIV的VP51、ICP18和VP96等（Xia et al.，2009，2010;Yu et al.，2016）。为验证SGIV MCP蛋白是否具有类似功能，使用稳定表达MCP蛋白的FHM-MCP细胞进行增殖试验，以CCK-8测定细胞活力，并绘制细胞生长增殖曲线，结果显示，MCP蛋白可有效促进FHM细胞增殖（图5），且细胞计数进一步证实MCP蛋白能调节细胞生长及促进细胞分裂增殖（图6）。
2. 6 MCP蛋白能提高SGIV感染细胞存活率及促进病毒复制
SGIV感染FHM细胞会引起典型的凋亡反应，导致细胞存活率下降（Huang et al.，2011）。为进一步阐明MCP蛋白的功能，检测FHM-MCP细胞在SGIV感染压力下的存活率变化。如图7所示，在SGIV感染后12 h，FHM-MCP细胞的存活率与对照组FHM-Vector细胞无显著差异（P>0.05）;在SGIV感染后24和48 h，FHM-MCP细胞的存活率均显著高于对照组FHM-Vector细胞（P<0.05，下同），且FHM-MCP细胞在SGIV感染后24和48 h的存活率分别是FHM-Vector细胞的1.12和1.15倍。为揭示MCP对病毒复制的影响，采用TCID50法计算FHM-MCP细胞在SGIV感染压力下的滴度变化，结果（图8）显示，FHM-MCP细胞在SGIV感染后24和48 h，其病毒滴度均显著高于FHM-Vector细胞，说明MCP蛋白能促进SGIV病毒复制。
3 讨论
病毒侵染宿主细胞起始于病毒与细胞表面受体的接触结合，病毒在受体介导下进入宿主细胞，并在细胞内开始复制、组装和释放，而完成完整的侵染周期。在此过程中，病毒为了保证顺利完成复制、装配和传播等过程，会编码多种蛋白发挥调控作用（秦启伟和黄晓红，2019）。因此，深入开展病毒侵染宿主的基因组学、转录组学和蛋白组学等研究，可为阐明病毒侵入宿主细胞的分子机制及研发高效的靶向抗病毒药物和免疫防控产品提供参考依据。SGIV具有双链环状DNA，目前已有针对SGIV基因组学、转录组学和蛋白组学等的系统研究，相关结论部分揭示了SGIV的侵染致病机理。SGIV基因组全长140131 bp，共编码162个开放阅读框（ORF），而编码ORF的基因根据转录表达先后顺序又可被分為立即早期基因（Immediate-early，IE）、早期基因（Early，E）和晚期基因（Late，L）（Song et al.，2004）。SGIV在体外感染宿主细胞中存在15个IE转录本、89个E转录本及53个L转录本。ORF086R和ORF162L属于立即早期基因，二者的转录表达产物能促进细胞生长及促进SGIV复制;ORF016L、ORF019R、ORF088L和ORF039L属于晚期基因，能编码病毒囊膜蛋白。值得注意的是：在细胞系水平和鱼活体水平，SGIV感染的基因转录模式差异明显，尤其是在鱼活体水平SGIV感染的基因转录模式更复杂。为了抵抗病毒感染，宿主通过抑制与病毒复制有关的IE转录本和E转录本以干扰病毒复制，最终实现对病毒的免疫清除（秦启伟和黄晓红，2019）。本研究通过分析SGIV MCP基因转录时序，证实MCP基因是一个晚期基因，其编码MCP蛋白是构成SGIV核衣壳的主要结构蛋白（Song et al.，2004），与针对大鲵虹彩病毒的研究结果（Chinchar et al.，2011;周小愿等，2016）一致。
最新研究结果显示，除了非结构蛋白，病毒的结构蛋白也能在病毒的侵染及复制过程中发挥重要调控作用（Yu et al.，2016;Lu et al.，2017）。草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）的外衣壳蛋白VP5作为重要的结构蛋白，能与VP7结合形成三聚体复合物，进而在GCRV表面构成三聚体网络，以保护病毒粒子及维持病毒结构稳定（Fang et al.，2005）。此外，VP5能与宿主细胞膜上的层黏连蛋白（LamR）发生相互作用，进而介导GCRV吸附和侵入宿主细胞（Wang et al.，2016）。据报道，SGIV的外衣壳通过与宿主细胞膜相互作用，而介导病毒侵染进入宿主细胞;随后病毒在细胞内的复制促使病毒组装位点（Viral assembly site，VAS）形成，此时作为前体出现的膜结构通过招募衣壳蛋白，形成双壳新月形结构，进而形成二十面体衣壳。在此过程中，若抑制MCP蛋白表达，可有效阻断病毒衣壳形成（Liu et al.，2016）。本研究发现，虽然MCP基因在SGIV感染后8 h即出现少量表达，且随时间延长其转录表达水平持续增加，但MCP基因的转录表达在SGIV感染后8～16 h增加趋势较缓慢，直至感染24 h后其转录表达水平才显著增高，故推测前期少量表达的MCP蛋白可能对宿主细胞发挥部分调控功能，而后期大量表达的MCP蛋白主要参与SGIV的组装。 明确病毒蛋白在细胞内的定位可为其功能研究提供极具价值的思路与线索。本研究通过体外转染表达MCP融合蛋白，观察绿色荧光的分布情况以判定MCP蛋白的亚细胞定位，结果表明，SGIV MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中。说明SGIV主要在宿主细胞核附近的病毒加工厂中进行组装，而MCP蛋白正是构成其核衣壳的主要结构蛋白（秦启伟和黄晓红，2019）。也有研究显示，在SGIV感染宿主细胞的过程中，MCP蛋白会出现在细胞膜上。Yu等（2019a）利用特异性识别SGIV侵染宿主细胞的核酸适配体Q5，通过微纳米磁珠—磁性分离技术和质谱技术对核酸适配体的靶标蛋白进行分离、富集与鉴定，证明核酸适配体Q5在SGIV感染细胞上的靶标蛋白即为MCP蛋白。该研究成果首次证明SGIV在侵染过程中其MCP蛋白可能会出现在细胞膜上（Li et al.，2015;Yu et al.，2019a）。为进一步探究MCP蛋白影响SGIV侵染宿主细胞的作用机制，Yu等（2020）利用核酸适配体Q5构建了高特异性的荧光分子探针，并通过Q5荧光探针研究MCP蛋白在病毒感染宿主内的转运机制，证实MCP蛋白进入宿主细胞不依赖于网格蛋白介导的内吞途径，也不依赖于巨胞饮途径，而是主要依赖小窝蛋白介导的内吞途径，同时需要发动蛋白（Dynamin）参与，且依赖于低pH条件和细胞骨架微丝。该结论不仅从崭新的角度阐明SGIV侵染致病的分子机理及MCP蛋白的作用机制，还为从活细胞水平研究病毒生命活动提供理想的病毒—细胞模型和探针工具，进而为研发有效的抗病毒手段提供新思路。
病毒在侵染过程中会编码一些基因以调节细胞周期，影响宿主细胞的分裂增殖，最终促进病毒复制（Xia et al.，2009，2010）。人类巨细胞病毒会通过US27基因产物调控细胞周期及增强细胞增殖（La-res et al.，2013）。SGIV的ORF51基因能转录表达肿瘤坏死因子受体（TNFR）类似物，可有效调节细胞生长及促进病毒复制（Yu et al.，2016）。本研究也发现，SGIV的MCP基因不仅能促进细胞分裂增殖，还可提高SGIV感染压力下的细胞存活率。故推测MCP蛋白在SGIV的侵染过程中对宿主细胞生长具有一定调节作用，能促使SGIV更有效地完成复制，最终提高病毒滴度和病毒感染力。
4 结论
SGIV的MCP基因是一个晚期基因，其编码蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中，通过促进宿主细胞分裂增殖及病毒复制，最终提高SGIV的病毒滴度和感染力。
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（責任编辑 兰宗宝）